NeoSPR应用(二)-核酸适配体亲和力

　　一、简介

　　1 核酸适配体

　　Aptamer有中文译作核酸适配体(也有人译为核酸识体、核酸适体或核酸适配子)，是能够高亲和力和稳定性结合目标抗原的单链RNA或DNA分子。现在其抗原类型更为广博，已经发展了针对涵盖包括小分子有机物、多肽、蛋白、组织和细胞等不同目标分子和细胞的aptamer。Aptamer技术由L. Gold和J. Szostak (2009年获诺贝尔生理学和医学奖)最早提出。1990年Gold研究组运用体外筛选技术获得能与T4 DNA聚合酶特异性结合的RNA分子，并将其运用的寡核苷酸配体筛选方法定义为配体指数富集的系统进化(the systematic evolution of ligands by exponential enrichment process)，简称SELEX。同年，Szostak等人也报道了能结合小分子有机染料的RNA片段。Gold和Szostak的这一突破性研究证实核酸分子能够借助氢键、范德华力、疏水作用等分子间作用力形成与分子靶标相作用的结合口袋和裂隙(binding pockets and clefts)，借助这些特殊的三维立体结构，高亲和力和特异性的识别并结合靶分子。

　　2 核酸适配体应用

　　新药研发

　　Aptamer可以作为药物分子或先导分子，至2017年，Nexstar当初转给EyeTech Pharmaceuticals的Macugen于2004年获批，其他为数不多的产品都在II期或者III期。Macugen是一种选择性血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂，用于老年性视网膜黄斑营养不良(AMD)的治疗。同时，根据aptamer的反义序列设计的antidote还可作为解毒剂与aptamer联合应用，及时清除体内过量aptamer分子。

　　疾病诊断和成像

　　已有荧光标记的抗人凝血素核酸适配体用于体内诊断的报道。作为示踪剂，寡核苷酸适配体具备了作为导向剂所需要的所有特性，其分子可以结合放射性核素、毒素等，并递送到靶组织，它同时具有直接抑制靶蛋白的功能，是非常有潜力的体内显像和治疗药物。

　　靶物质的分析与检测

　　Aptamer作为识别分子进行蛋白、多肽、小分子等的检测，涉及的检测方法可以包括荧光、电化学、比色、SPR等。

　　3 核酸适配体筛选

　　核酸适配体筛选一般使用指数富集的配体系统进化技术(SELEX)，从核酸文库中进行几轮筛选和扩增循环，与靶分子有较强亲和力的aptamer被富集;对筛选完成的序列进行亲和力鉴定。

　　4 核酸适配体优缺点

　　与抗体相比，核酸适配体的筛选周期短;适合于毒素和低免疫原性抗原;工作浓度低;批次差异性小;放大工艺简单;低成本;稳定易保存;常温运输。

　　SELEX过程在人为环境中完成，这些人为环境与生理环境不同，因此得到的aptamer的亲和性没有抗体高;专利问题限制了Aptamer的大规模商业化开发(专利大约在2020年左右会到期);结合位点研究缺乏问题，很多aptamer筛选出来，对分析出序列中的binding sites缺乏进一步研究。

　　二、NeoSPR在核酸适配体方面的应用

　　NeoSPR可用于1核酸适配体筛选之后的亲和力、动力学分析，为核酸适配体的结合亲和力提供定量数据。2靶物质的定性定量分析。

　　亲和力、动力学分析

　　方法一：以SA芯片捕获生物素标记核酸适配体，以蛋白未流动相进行亲和力分析。

　　方法二：将蛋白固定在芯片表面，以核酸适配体为流动相进行亲和力分析。

　　案例一：CD63适配体和CD63亲和力分析

　　CD63与CD63核酸适配体进行实验后，两种方法下均未检测到明显信号变化，怀疑两者之间结合能力差。后续更换核酸适配体和蛋白进行检测。具体实验结果见《NeoSPR-CD63核酸适配体&CD63相互作用实验》

　　案例二：SA与SA核酸适配体

　　用SA芯片捕获生物素化的SA核酸适配体，然后进行该核酸适配体与SA之间的亲和力测定，结果可以进行亲和力测定。具体实验结果见《NeoSPR-SA核酸适配体&SA相互作用实验》。

　　靶物质定性和定量分析

　　以SA芯片捕获生物素标记核酸适配体，然后检测不同浓度靶物质响应信号，做标准曲线;对未知浓度样本进行定性和定量分析。

　　补充1：一家专门筛选核酸适配体的公司安徽昂普拓迈生物科技，于2020.04.01举行《核酸适配体在新冠疫情中的应用》专题网络研讨会，涉及相关进行适配体研究的学校和老师信息。该次会议涉及亲和力检测产品为nano temper

　　https://www.ddpcr.ltd/newsinfo/397637.html(内含报告老师信息)

　　上海博豪医学检验所有限公司适配体中心提供适配体筛选服务，可以评估已知适配体专一性和亲和力

　　http://www.biomedlab.cn/newsitem/277577307(内含课题组信息)

　　生工生物&AMBiotech X-Aptamer核酸适配体服务平台，筛选完成后进行特异性和亲和力分析。

　　https://www.sangon.com/services_itemresearch05.html

　　补充2：2004年FDA批准了全球第一个、由NeXstar公司研发的适配体药物Macugen(Pegaptanib)，靶向VEGFR，用于治疗老年黄斑病变(AMD)。可惜VEGFR单抗Avastin上市后疗效和安全性优于Pegaptanib，在2006年Lucentis上市后Pegaptanib出局。随后，Fovista(anti-PDGF)和Reg1(anti-FIXa)两款临床阶段的适配体药物相继失败，适配体逐渐被工业界边缘化。

　　目前有十余款适配体药物处于临床研究阶段。

　　https://www.antpedia.com/wxarticle/index.php?id=479458

　　补充3：2019年5月25日，在谭蔚泓院士的支持下，北京核酸适配体交叉技术学会成立

　　补充4:2020年12月31日，中国科学院肿瘤与基础医学研究所(筹)在政府采购网发布核酸适配体自动化筛选系统的公开招标公告，预算为735万元。