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支原体检测方法介绍

发布:大分子生物 阅读量: 技术平台 2022-11-04

支原体

支原体( Mycoplasma)属于柔膜体纲,是一种没有细胞壁、高度多样性、大小0.2~0.3um介于细菌和病毒之间的最小的核细胞型微生物。不能被革兰氏染色,但可在琼脂固体平板上形成“菌落”且可被甲基蓝染色。

支原体污染是细胞培养中的一个常见问题,据报道,大约5-15%的细胞培养物被支原体污染。历史上对支原体感染流行率的估计高达35%。支原体的高污染率可能是由于其各种来源,如受污染的培养基和血清、原始组织或细胞的污染以及不当操作引起的污染。尽管自然界中存在的支原体有120 多种,但污染细胞的支原体主要有5种,分别为牛源的莱氏无胆甾原体和精氨酸支原体,人源的口腔支原体和发酵支原体,猪源的猪鼻支原体,这5 种支原体占所有支原体污染的95%以上。

人成纤维细胞表面支原体的扫描电镜观察(图片来源知乎)

人成纤维细胞表面支原体的扫描电镜观察(图片来源知乎)

支原体带来的危害

细胞受支原体污染程度较轻时,不会表现出明显的异常,但也可能导致包括染色体畸变、生长抑制和各种细胞因子的产生等。在生物制药行业,支原体污染不仅导致产品品质下降,还会降低表达水平并最终导致产量降低,如污染了精氨酸支原体的抗体生产所用CHO DG44反应器中,发现在污染2-6天后开始产生副作用,使得细胞生长速率降低并导致反应体系内DO和pH改变。

支原体检测法规

支原体的检测属于医药监管的一部分,《中国药典》2020年版 四部 3301支原体检查:

主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行支原体检查时,应同时进行培养法和指示细胞培养法(DNA染色法)。病毒类疫苗的病毒收获液、原液采用培养法检查支原体;必要时,亦可采用指示细胞培养法筛选培养基。也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法。

我们且来看看每种不同的检测方法:

1.培养法

检查支原体采用支原体液体培养基和支原体半流体培养基。半流体培养基在使用前应煮沸10-15min,冷却至56℃,然后加入灭能小牛血清(培养基:血清8:2),并可酌情加入适量青霉素,充分摇匀。液体培养基无需煮沸,其他同样。

支原体检测方法介绍(图2)

供试品如在分装后24小时以内进行支原体检查时可贮存于2~8℃;超过24小时应置于-20℃以下贮存。

培养条件:36℃±1℃培养21天,每隔3天观察1次。

结果判定:培养结束时,如接种供试品的培养基均无支原体生长,则供试品判为合格。如疑有支原体生长,可取供试品加倍量复试,如无支原体生长,供试品判为合格;如仍有支原体生长,则供试品判为不合格。

2. 指示细胞培养法(DNA染色法)

将供试品接种于指示细胞(无污染的Vero细胞或经国家药品鉴定机构认可的其他细胞)中培养,用特意荧光染料染色。如支原体污染供试品,在荧光显微镜下可见附在细胞表面的支原体DNA着色。

支原体检测方法介绍(图3)

结果判定(1)阴性对照:仅见指示细胞的细胞核呈现黄绿色荧光。(2)阳性对照:荧光显微镜下除细胞外,可见大小不等、不规律黄绿色荧光。

当阴性及阳性对照均成立时,试验有效。如供试品结果为阴性,则供试品判为合格;如供试品为阳性或者可疑,应进行重试,如仍未阳性,供试品判为不合格。

PCR 方法

传统的支原体检测方法通常需要较长时间,如培养法至少需要28天,已经无法满足如CAR-T等药物放行的时间要求,亟需新的检测方法以供选择。核酸扩增技术(NAT)由于其快速、特异性强,在支原体检测中越来越受到人们的青睐,但首先必须达到或超过药典方法的灵敏度。使用NAT快速检测支原体已有很多技术和文献的发表,我们以《A Rapid and Sensitive Nucleic Acid Amplification Technique for Mycoplasma Screening of Cell Therapy Products》为例

该方案涉及从细胞治疗产品样品中提取DNA,通过PCR扩增支原体核酸,并通过凝胶电泳进行可视化分析。通过添加规定数量的支原体基因组DNA(gDNA),避免使用活支原体来证明检测敏感性,该DNA通过经验推导的基因组拷贝与CFU(GC/CFU)比值转换为CFU/mL值。为了满足监管要求,新的检测方法必须经过内部认证,以满足或超过药典方法的灵敏度,对于支原体属的灵敏度为10 CFU/mL。

支原体检测方法介绍(图4)

该简化示意图总结了标准DNA制备(≤5 *106个总细胞/mL)样品处理步骤和检测要求。处理四个450mL细胞样品等分试样以产生190mL中的DNA。将10mL EB(测试样品)或10mL稀释gDNA(加标对照试验)添加到每个小瓶中,使最终体积达到200mL。将精氨酸支原体(18GC,10mL)或人源支原体(107.2GC,10ml)gDNA添加到每个加标试验控制样品中,以测试10CFU/mL的检测要求。

支原体检测方法介绍(图5)

精氨酸支原体gDNA稀释至150基因组拷贝数(GC)/200 mL的3个反应中有3个出现了400至500 bp的阳性条带,15 GC/200 mL反应中有10个出现了阳性条带。这就确定了精氨酸分枝杆菌的LLOD为15 GC/200mL,低于18 GC/200mL的要求(相当于10 CFU/mL),人支原体亦显示出同样的检测结果。特异性测试,在过程中和药物产品样品上进行支原体检测试验,以证明细胞基质不会干扰支原体检测,所有实验均取得成功。

支原体检测的终极方法

核酸扩增技术(NAT)已经逐步应用到了支原体的常规筛查,市面上并有多款试剂盒产品的上市,并经历了市场上的初步验证。但PCR存在操作复杂,并且灵敏度较低的问题;QPCR则需要标准曲线进行定量,依赖于标准品。数字PCR是第三代PCR技术,由于其根据将样本预混液分散到成千上万的反应微滴,对每个微滴进行荧光信号读取,根据阳性微滴比例直接进行统计学分析获得样本的绝对定量。数字PCR检测灵敏度可以达到单拷贝,并且摆脱对标准品的依赖,将成为病毒、支原体等病原体最有潜力的技术。

关于纽辰生物

纽辰生物是专注于数字 PCR 技术和应用开发供应商,根据国内自研数字 PCR 平台、 MEMS 工艺打造硅基底纳米级微腔芯片、试剂,为客户提供更好的数字PCR应用解决方案。您只需要提供有价值应用,纽辰生物将为提供数字 PCR 平台、技术服务、项目合作等全方位供应。

支原体检测方法介绍(图6)


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