文章名称：High-throughput quantitative proteomics using Zeno SWATH data-independent analysis (DIA) and the Evosep One system

期刊：Sciex application note

Abstract:

Identifying and quantifying large numbers of proteins and peptides are important in translational research to understand biological functions. One example of this is the analysis of large sample cohorts to identify robust biomarkers of disease. The complexity of biological fluids, tissues and cell lines often overwhelms the capabilities of data-dependent acquisition (DDA) strategies using mass spectrometry due to the stochastic nature of this methodology. This limitation has driven the rapid adoption of data-independent acquisition (DIA or SWATH DIA) approaches, such as Zeno SWATH DIA. This method achieves 5-6x more MS/MS sensitivity, resulting in this DIA approach surpassing DDA for protein identifications and quantification in complex matrices. This advantage is further observed at short acquisition times that are required to meet the throughput demands of current proteomics studies. To meet the demands of high-throughput proteomics, the Evosep One system (Evosep) provides standardized liquid chromatography with preset methods and disposable trap columns. The system is optimized such that the user selects the number of samples to run per day (SPD) to determine the column, flow rates and run times necessary for analysis. The system is highly reproducible, robust and offers high MS utilization. These system features are ideal for applications in high-throughput laboratories.

研究背景

识别和量化大量的蛋白质和多肽对于理解生物功能的翻译研究具有重要意义。其中一个例子是对大样本队列进行分析，以确定疾病的可靠生物标记物。由于这种方法的随机性，生物流体、组织和细胞系的复杂性往往压倒了使用质谱的数据依赖获取(DDA)策略的能力。这一限制推动了数据独立获取(DIA或SWATH DIA)方法的快速采用，如Zeno SWATH DIA。该方法的MS/MS灵敏度提高了5-6倍，使得该DIA方法在复杂矩阵的蛋白质鉴定和定量方面超过了DDA。为了满足高通量蛋白质组学的需求，Evosep One系统(Evosep)提供了标准化的方法和一次性捕获柱柱。该系统经过优化，用户可以选择每天运行的样品数量(SPD)，以确定分析所需的运行时间。该系统具有高度的可重复性，稳健性和质谱利用率。本研究将Evosep One系统和ZenoTOF 7600系统结合起来进行快速定量蛋白质组学研究，使用Zeno SWATH DIA研究在不同SPD下可检测的蛋白数量。

试验方法

样品制备:用95%缓冲液A(水加0.1%甲酸)和5%缓冲液B(乙腈加0.1%甲酸)重组人商业细胞胰蛋白酶消化液，分别稀释至1.25 ng/µL (25 ng负载)，2.5 ng/µL (50 ng负载)，10 ng/µL (200 ng负载)，25 ng/µL (500 ng负载)。将各浓度的20 μ L样品装入Evotips进行样品注射。。

色谱:Evosep One系统使用预置的SPD配置进行操作，流量和色谱根据供应商的规格进行了调整。Evosep One系统的控制与SCIEX OS软件完全集成，单个批次可用于控制LC和MS。

质谱分析:ZenoTOF 7600系统使用OptiFlow Turbo V离子源，在Zeno SWATH DIA模式下工作。在微流配置下运行200 SPD、100 SPD和60 SPD方法，在纳流配置下运行30 SPD方法，每个测试条件进行三份分析。

数据处理:Zeno SWATH的DIA数据使用DIA-nn软件beta版1.8.1.3进行处理。

实验结果及讨论

1. 蛋白质定量

经过消化的HeLa细胞裂解液在ZenoTOF 7600系统上使用Zeno SWATH DIA来表征各种SPD工作流程。在该实验中，使用了200和50 ng的样品负载(分别图1和图2)。这种特性允许用户选择与蛋白质组覆盖深度和通量最匹配的工作流程和所需样品数量，以满足他们的实验需求。

图1. 评估LC工作流和定量蛋白之间的关系

对于两个加载量，随着SPD的减少和样品分析时间的增加，鉴定和定量的蛋白数量增加(图2)。当通量从200 SPD减少到30 SPD时，在50ng上样量下多鉴定了102%，而200 ng上样量下也多鉴定了82%的蛋白。对于50 ng的HeLa细胞裂解液(图2)，30 SPD工作流提供了最大的蛋白质组覆盖。使用Zeno SWATH DIA检测5727个蛋白组 (图2)，在此负载和SPD工作流程下，74%的蛋白得到可靠的定量。

图2. 比较不同SPD下的蛋白质定量结果

使用100 SPD工作流和200 ng的HeLa消化样品(图1)，检测了5499个蛋白组，并在CV <20%的情况下对4870个(88%)进行了重复定量。因此，该方法提供了蛋白质组覆盖和高样品通量。当通量降低到30 SPD，并加载200 ng的HeLa消化液时，检测到7014个蛋白组。

2. 来自 Zeno SWATH DIA 数据的无文库蛋白质鉴定

对200 ng HeLa细胞裂解液的数据分析表明，使用无库方法可以获得良好的性能。在30 SPD的条件下, 6417个蛋白使用无文库的方法被鉴定，而7014个蛋白使用ZenoTOF 7600文库被鉴定(图3)。

图3. 在 200 ng 负载下比较无库方法和 2 个实验生成的库

Zeno SWATH DIA方法用于蛋白质鉴定的一个关键优势是能从Zeno MS/MS数据中获得定量信息，如图3所示。通常情况下，在所有工作流程中，当装载200 ng样品时，90%已鉴定的蛋白质也以<20% CV进行定量。无文库方法是一种非常有效的搜索策略，因为它可以在不生成样本和队列特异性文库的前提下对蛋白质进行鉴定和定量。

3. 肽前体量化

最后，作者研究了SPD和负载对肽前体量化数量的影响(图4)。在200 ng的负载下，在200 SPD下量化了约15000个前体，在30 SPD下量化了约42000个前体(图4)。当通量从100 SPD降低到60 SPD时，识别率提高了43%，表现最为显著。而60 SPD的通量在检测和量化性能之间提供了平衡。

正如预期的那样，较低的SPD通量和较高的负载导致了蛋白质检测和定量的增加。这里提供的蛋白质和肽数据可以作为指导选择合适的样品负荷和所需的通量，以满足未来的研究需要。

图4. 不同SPD条件下的肽前体定量

参考文献

Batruch, Ihor, et al. "High-throughput quantitative proteomics using Zeno SWATH data-independent analysis (DIA) and the Evosep One system."