背景

肿瘤微环境 (TME) 它是肿瘤发生、发展、反应和抗肿瘤治疗的重要因素，在肿瘤预后和抗肿瘤药物作用中起着重要作用;

肿瘤微环境中的免疫环境也备受关注。例如，在开发抗肿瘤药物时，靶向免疫检查点的药物往往会开发出来。一旦成功，通常会产生持久的抗肿瘤作用。

图1.免疫细胞对肿瘤微环境的影响

肿瘤免疫疗法的出现改变了传统的癌症治疗模式，研究和识别与免疫检查点抑制剂疗效相关的生物标志物尤为迫切和重要。多种免疫组合技术 (mIHC)它可以作为肿瘤免疫和生物标志物研究的有力工具，同时评估同一组织切片中各种生物标志物的表达。

多重免疫组化(mIHC)技术

顾名思义，多种免疫组化技术可以在组织切片上检测多种生物标志物，主要利用不同标志物上的抗体识别组织切片上的靶蛋白，然后通过必要的实验平台或专业仪器收集和分析图像。由于获得了大量的生物学信息，不仅可以分析组织细胞原位靶的类别、组分、表达等信息，还可以研究各靶相互作用的空间位置信息， mIHC 该技术在肿瘤微环境、肿瘤异质性和肿瘤发生发展方面发挥着重要作用。

技术优势

✔ 多靶标同时检测与分析，同步揭示原位表达量及定位情况

✔ 易于对空间位置信息进行分析，可区分细胞亚群并分析细胞社群关系

✔ 实验材料抗体选择可以不用考虑不同种属搭配，降低选择难度

✔ 分析灵活，多靶标染色结果可自由组合进行分析，也可单独拆分信号

代表性技术

01、TSA技术

TSA 即酪酰胺信号放大技术(Tyramide signal amplification),酪胺是其主要原理(Tyramide)过氧化物酶反应(酪胺盐 HRP 催化H202年形成共价键结合点)，产生大量酶促产物，可与周围蛋白质残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，使蛋白质样品与荧光素稳定结合，在组织切片上标记7-9个目标。

图2.TSA技术染色原理

TSA 技术利用循环染色的方式实现多重荧光标记，酪胺荧光素与靶蛋白的结合是共价结合，而一抗与靶蛋白之间的结合是非共价结合。利用这一特性，微波加热可以去除结合的一抗。第一轮一抗二抗被洗掉，荧光标记的酪胺仍附着在靶周围。在检测第二个目标时，它相当于一个新的一轮标记，不需要考虑第二轮抗体是否与第一轮抗体产生种属差异。多个靶标的标记只能通过改变不同荧光标记的酪胺来实现，因此即使选择相同属的抗体，也不会影响实验结果。

图3.人扁桃体组织TSA技术染色结果

anti-PD1 (ab237728; orange; Opal™520),

anti-PDL1 (ab237726; green; Opal™540),

anti-CD68 (ab192847; yellow; Opal™570), anti-CD3 (ab16669; red; Opal™620),

anti-Ki67 (ab16667; light blue; Opal™650) and anti-PanCK (ab7753; grey; Opal™690);

DAPI (dark blue).

02、成像质谱流式

成像质谱流式(Imaging Mass Cytometry，IMC)创新性的使用金属标签抗体(主要是镧系金属)标记单细胞悬液或者组织切片样本，以质谱作为检测手段，从根本上解决了传统荧光标记技术由于光谱叠加导致的串色问题，可以实现数十种抗体标记物检测，可以对样本的细胞亚群和功能进行全面和精细的分析。

图4.质谱流式成像技术原理及工作流程

成像质谱流式用的抗体是镧系金属元素及其同位素标记的标签抗体，使用金属元素进行标记的优点是：

01、在细胞内含量少，不会引起高的背景噪音干扰。而荧光流式会面临样本自发荧光的干扰;

02、不会影响细胞正常的生理功能;

03、ICP 质谱装置分辨率高，彼此信号无干扰，无需通过计算补偿。

目前用来标记抗体的商品化金属标签抗体有 180 多种，如果所需标记的靶点没有已经标记好的抗体，需要自行购买相应靶标的无载体抗体与 Maxpar® X8 试剂盒进行抗体标记后，再进行相关实验。

图5. MaxPar® X8试剂盒进行抗体金属标记过程

PhenoCycler-Fusion

PhenoCycler 解决方案(原 CODEX®)核心原理是利用特异性寡核苷酸“条形码标签”(Barcode)标记对抗体进行标记后进行组织成像。成像所需的荧光染料和 Barcode 互补的寡核苷酸序列特异性结合，首轮加入的荧光染料会收获第一轮染色结果，多轮 Barcode 的加入收集染色图片，最终可实现 100 种或更多蛋白指标的同时检测及分析。

图6. PhenoCycler 工作原理及流程

近期Akoya Biosciences首次展示在PhenoCycler-Fusion 从单细胞原位空间组学分析系统中获得的全新组织片 103 基于癌症特征的标志物数据集 103 如何在口咽鳞状细胞癌样本中揭示独特的免疫、代谢和应激特征?

图7.Akoya-Abcam 单细胞原位 103 个标记物空间表型数据海报

使用的关键因素之一是获得可靠的超多重单细胞原位空间组学分析数据 DNA Barcode 偶联抗体的特异性和敏感性。在这个样本中，人口咽鳞状细胞癌 103 52 在需要做偶联的靶点抗体中，有 39 个来自 Abcam 重组 RabMAb 兔单抗。

参考文献

[1]Zou W. Immunosuppressive networks in the tumour environment and their therapeutic relevance. Nat Rev Cancer,5(4):263-274(2005)

[2]Leone, R.D., Powell, J.D. Metabolism of immune cells in cancer. Nat Rev Cancer 20, 516–531 (2020).

[3] Topalian S L, Drake C G, Pardoll D M. Immune checkpoint blockade: a common denominator approach to cancer therapy. Cancer Cell. 2015;27(4):450-461

[4]Hanahan D, Weinberg R A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell,144(5):646-674(2011).