Title：Robust and high-throughput single cell proteomics with the Evosep One

Journal：Evosep Application note

Date：2022.06

Introduction：

Recent advancements in the robustness and sensitivity of sample preparation, liquid chromatography and mass spectrometry instrumentation and workflows have enabled efficient single cell proteomics. WhisperTM Flow Technology is specifically developed for high sensitivity applications such as single cell analysis. Ongoing improvements of Whisper combined with a new generation Evotip provide efficient capture and recovery of peptides from very low sample amounts down to the single cell level. Additional optimizations include a new 15 cm column from IonOpticks (75 µm ID with 1.7 µm beads, Generation 3 Aurora Elite), that works well together with the single use and disposable trap columns with a slightly more hydrophobic material. We have satisfactorily tested this column for the Whisper 40 and 20 SPD methods. It can be used as a direct replacement for EV1112 to increase the performance. However, the temperature should be maintained at 50 °C. Here, we demonstrate the sensitivity and robustness of our Whisper 40 SPD method in combination with the fast and sensitive timsTOF SCP mass spectrometer using data-independent acquisition parallel accumulation serial fragmentation (dia-PASEF). Furthermore, we applied it to sorted single cells, a field in rapid development, to understand heterogeneity within complex systems.

图1：单细胞分析的工作流程。

Hela样本，以0.625、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16和32 ng的稀释液，每个重复6次，肽段加载到EvoTip Pure上。用CellenONE分离、收集和消化HeLa细胞，其中1、5和10个细胞分别收集在不同的ProteoCHIP孔中，样品采用Aurora Elite色谱柱(15cm，75um ID，1.7um粒径)，温度为50℃，采用Whisper 40 SPD方法。喷雾电压为1500 V，并以DIA-PASEF模式运行。范围从400-1000 m/z和0.64-1.40 1/K0，周期时间为0.95秒。

1. 色谱性能

我们最初评估了基于Evotip Pure上加载的 5 ng HeLa的色谱性能，使用40 SPD方法在dia-PASEF 模式下分析。根据m/z 599.75、566.75和663.84 (±0.02 Da)的提取离子色谱图，来监测峰性能和保留时间稳定性。亲水性肽(m/z 599.75)四次重复进样的半峰宽(FWHM)为2.5秒，而其他肽(m/z 566.75和663.84)四次重复为平均4秒(图 2A)。基于10次进样，这些选定肽的保留时间非常稳定(图 2B)。

图2：(A)从5 ng HeLa中提取的m/z为599.75、566.75和663.84的离子色谱图。(B)10次重复进样保留时间的重复性。

2. 可重复稀释系列

我们评估了我们的工作流程的敏感度，用六次上清液(PILES)分析了一系列稀释的HeLa多肽，范围从62.5 pg到32 ng。从对应于单细胞水平的125 pg中，我们确定了近6,000个肽段和1,500个蛋白质，32 ng高于50,000个肽段和近6,500个蛋白质(图3A和B)。稀释系列显示了良好的线性以及重现性在整个梯度有很好地分布，在高载荷时，每分钟识别的前体接近3,500个。在梯度过程中，低载荷仍然显示出稳健的识别率，500 PG达到了每分钟500个识别的前体(图3C)。

图3：(A)多肽和(B)以六次测量的稀释度系列的蛋白质鉴定。(C)所有负载在整个梯度中每分钟的前体。

3. 灵敏的单细胞蛋白质组

为了进一步挑战敏感性，我们分析了单个分选的HeLa细胞。这些细胞被分配到1个、5个或10个细胞中，细胞1个放在单独的蛋白芯片孔中，进行裂解和消化。分析了6个单独的单细胞，分别包括5个和10个细胞的四重测量。单细胞蛋白质组显示了很好的覆盖范围，平均每个细胞识别出7,500个肽，对应1,500个蛋白质，除了技术参数外，这些蛋白质的变异可能是由于细胞周期和其他功能细胞状态的生物变异(图4A和4B)。从5个和10个细胞，超过2,500和4,000个蛋白质的深层蛋白质组用Whisper设置测量(图4C)。当将从单细胞获得的蛋白质组深度与HeLa参考稀释系列进行比较时，我们发现从实际单细胞获得的蛋白质组覆盖率与250 pg HeLa消化获得的深度相匹配。

图4：(A)肽和(B)来自单个单细胞测量的蛋白质鉴定。(C)来自1、5和10个细胞的组合识别。

IonOpticks的Aurora Elite柱、Evosep One的Whisper方法和timsTOF SCP上的dia-PASEF相结合，提供了灵敏度、稳健性和高通量的单细胞分析。总体而言，所展示的工作流程绘制了覆盖多达1,800种蛋白质的单细胞蛋白质组图，推动了跨不同细胞群体的蛋白质水平检测。cellen ONE为单细胞样本分选提供准备工作流程。值得注意的是，这些是通过无标签实现的，并且可以通过实现用于多路复用的质量标签来改善，这也将进一步提高鉴定量和通量。

Robust and high-throughput single cell proteomics with the Evosep One https://www.evosep.com/wp-content/uploads/022/06/AN-018A-Whisper 40SPD_SingleCell.pdf