邮箱:mamobio@163.com

首页 > 知识库 > 疾病研究 > 以质谱为基础的“组学”研究妊娠糖尿病和发现新的生物标志物

知识库

推荐新闻

研究新闻

产业文章

以质谱为基础的“组学”研究妊娠糖尿病和发现新的生物标志物

发布:大分子生物 阅读量: 疾病研究 2022-06-30

糖尿病(GDM)是妊娠最常见的并发症之一。人们通常通过口服葡萄糖耐量试验来诊断GDM,但国际上仍缺乏统一的检测方法和阈值。GDM的短期和长期影响包括肥胖、增加患二型糖尿病和心血管疾病的风险。我们需要识别和验证敏感的、高选择性的和稳定的生物标志物,这些生物标志物可用于早期妊娠诊断,并预测出生后可能的不良后果。基于质谱(MS)的组学技术是在分子水平上表征各种病理的优选方法。近10年来,GDM的蛋白质组学和代谢组学得到了广泛的研究,许多蛋白质和代谢物被发现是潜在的生物标志物。GDM的元组学也有报道,但相关研究很少。本文重点介绍了GDM相关组学研究的不同分析方法和基于MS的仪器平台,描述了各种生物标本的制备方法,并对结果进行了简要总结。总的来说,目前的研究只报道了最初的生物标志物,人们需要做进一步的努力来确定GDM的确切生物标志物。

原名:Mass spectrometry-based “omics” technologies for the study of gestational diabetes and the discovery of new biomarkers

译名:基于质谱的妊娠期糖尿病“组学”研究和新生物标志物的发现

期刊:Mass Spectrometry Reviews

IF:9.011

发表时间:2022.04

通讯作者:Marco Roverso

作者单位:意大利帕多瓦大学,化学科学系

主要内容

1. 基因检测结果

妊娠期糖尿病(GDM)主要是就是指在一个怀孕前没有,而怀孕后才引发的糖尿病,它是企业由于我国妊娠期出现一系列重要生理发展变化情况造成糖代谢功能异常而引起的。妊娠的特征是由于黄体酮和皮质醇等激素的存在而导致外周组织的生理性胰岛素可以抵抗。从妊娠18周开始,激素的作用在脂肪和肌肉活动组织中尤其对于相关,导致大量葡萄糖通过利用有效减少,进而影响导致生理性餐后高血糖,胰岛素细胞分泌从而增加,并发展为生理性的胰腺增生。胰岛素供应能力不足会导致产生葡萄糖稳态受损、高血糖和GDM。

GDM的危险因素包括肥胖、母亲年龄增加、2型糖尿病(T2D)、既往有GDM病史或不良妊娠结局以及种族差异。 妊娠中期和晚期血糖控制不良可能导致以高血糖和慢性高胰岛素血症为特征的状况,随后胎盘需氧量增加。 患有糖尿病的母亲可以促进胎儿的发育,特别是通过扩大对胰岛素活性敏感的器官,导致巨大儿。 GDM母亲所生婴儿的主要新生儿并发症是先天性畸形、早产、围产期窒息、呼吸窘迫、代谢并发症、血液学问题、高胆红素血症和心肌病。 GDM的长期并发症包括T2D、糖耐量受损、肥胖和成年期神经发育异常。 此外,高血糖和不良妊娠结局(HAPO)研究表明,妊娠24-28周的孕妇血糖升高始终增加孕妇、胎儿和新生儿出现不良结局的风险。

由于缺乏普遍接受的诊断标准,很难估计 gdm 的患病率。国际糖尿病和妊娠研究小组(iadpsg) ,美国糖尿病协会(ada)(2019)和世界卫生组织(who)(2013)报道,国际上常规使用几种不同的诊断方案。然而,对于诊断检测方法和阈值仍然缺乏统一的标准。

因此,组学科学的重要性尤为突出,因为通过“整体”方法,组学可以从“体内”收集的生物样本入手来反映患者的病理状况,进而定义疾病模型。

对于GDM,寻找可以选择性、灵敏和可靠的生物标志物对于企业开发新的筛查策略或诊断分析方法是至关重要的,这些新的筛查策略或诊断技术方法我们将在中国临床教学实践中学习使用,并能够进行识别怀孕前三个月内有风险的患者。此外,生物标志物也是一种评估GDM对母亲和胎儿健康发展以及提高儿童和老年疾病发病机制影响的基础。

在过去的十年里,已经发表了大量的研究,包括应用基于MS的组织化学策略来评估GDM的生理病理学特征。 以及确定用于疾病诊断或长期并发症预测的潜在生物标志物。 本文旨在通过蛋白质组学、代谢组学和金属组学的研究,描述和评价在GDM条件下收集的不同组织和生物流体的不同分析方法和方法。 本综述未涉及结果和临床/生物学数据的解释,特别是关于结果的可靠性,因为它们已在其他地方广泛报道和讨论。

2. GDM组学工作流程的基础

组学工作流程通过“盲目的”或非靶向的方法从样品分析开始产生有价值的信息。然而,此类信息的准确性和重要性严格依赖于几个预先分析步骤,人们应该在开始之前进行深入评估,以避免收集道误导性和非代表性的数据。

第一步是实验设计。文献中报道的大多数研究都是基于两两比较。具体而言,通过比较从两组感兴趣的患者(即从GDM患者收集的样品和来自正常葡萄糖耐量(NGT)的对照孕妇样品)获得的数据,突出了上调或下调的化学标志物。样本量是这类研究中应该考虑的主要参数之一,应该正确评估。遵循预先制定的标准操作程序正确采集样品并正确储存(通常在80°C下),对于获得准确可靠的数据也至关重要。此外,人们应准确评估添加防腐剂或蛋白水解酶抑制剂,但这些信息通常在综述研究中是缺失的。样本收集应通过获取后续统计评估所需的其他数据来补充,包括考虑潜在的混杂因素,特别是孕妇年龄、种族、孕前身体质量指数(BMI)、分娩类型、婴儿胎龄、婴儿性别和出生体重。报道的研究还考虑了排除标准,如吸烟、T2D家族史、明显的糖尿病和其他混杂疾病的存在,以避免收集可能影响分析可靠性的非特异性样本。

人们也应该正确评估患者的分层。除少数例外,GDM通常通过口服葡萄糖耐量试验(OGTT)进行诊断,即在妊娠24-28周期间给母亲服用75克葡萄糖。然而,许多研究的诊断标准通常是不同的,这取决于不同国家和标准发表年份。这种不相容性给实验结果的对比带来了困难,因为孕妇群体并不是同质的。

3. 基于MS的GDM蛋白组学研究

蛋白质组学,即对细胞、组织或生物液中表达的蛋白质进行全面和系统的分析,在过去的10年里被广泛应用于GDM的研究。特别是,人们应用基于高通量MS的蛋白质组学方法在不同的样本中,例如母体血浆和血清、脐带血浆、胎盘组织、尿液、脂肪组织、骨骼肌和乳清,确定了几种在受GDM影响的孕妇中表达发生变化的蛋白质。研究结果表明与GDM的发展或进展密切相关的候选蛋白质生物标志物对开发新的和早期的诊断或预测方法、阐明疾病的生理病理或作为胎儿和母亲分娩结局的标志物具有潜在的极大帮助。

蛋白质组学分析基本上是通过两种不同的、有时是互补的方法来执行的。凝胶法是基于一维或二维电泳法(2DE)的蛋白质组研究的第一种方法;电泳条带中包含的差异表达显著的蛋白质将通过基质辅助激光解吸电离(MALDI)-MS或纳流液相色谱(nLC)-电喷雾(ESI)-串联MS(MS/MS)进行鉴定。研究表明,与MALDI-MS相比,nLC-ESI-MS/MS进行的鉴定通常可以获得更高的序列覆盖率和揭示低丰度蛋白质的更高可能性。第二种方法被定义为无凝胶方法,即通过对样品进行总蛋白含量的水解和MS分析,避免了使用电泳分离。差异表达的蛋白质通常是通过对蛋白质衍生多肽的定量或差异定量以及统计分析来表征的。一般来说,凝胶法更耗时,但更适合于分离和鉴定蛋白质异构体和翻译后修饰。另一方面,就样品制备而言,无凝胶方法更全面、更自动化、速度更快,即使需要更复杂和更高速的仪器,如高分辨率(HR)MS和强大的数据分析软件。大多数报道的研究是基于定量的无凝胶方法,而2DE仅在少数研究中使用。由于无凝胶方法可以鉴定更多数量的蛋白质,它也改善了对更多上调或下调蛋白质的评估。最先进的无凝胶定量方法依赖于等重标记或无标记定量方法。GDM蛋白质组学中的常见标记方法是基于相对和绝对定量的等重标记(iTRAQ)或串联质量标记(TMT)。人们通过等重标记或无标记定量研究了GDM发展过程中蛋白质表达的变化;对于同一样本,在鉴定上调或下调蛋白质方面,不同方法获得的结果是相似的。在样品中加入同位素标记的标准多肽混合物后,且在多反应监测(MRM)模式下,串联MS也可以对蛋白质进行相对定量。

对于所有样品,样品制备中最重要的程序是用适当的酶水解蛋白质,以获得易于分析、测序和鉴定的蛋白质衍生肽段。所有研究中,蛋白质在半胱氨酸残基之间的二硫键还原和烷基化后被猪或牛胰蛋白酶水解。典型的胰蛋白酶/蛋白质比例为1:30、1:50,少数研究使用1:100的比例。一项研究还报告了胰蛋白酶(1:50)与赖氨酸C (1:100)的联合使用。此外,许多文章报道了使用过滤辅助样品制备(FASP)技术进行蛋白质水解以提高蛋白质的覆盖率。通过这种方法,人们可以在普通的10-30 kDa的过滤装置中通过超速离心进行细胞和组织的裂解、蛋白质还原、烷基化和水解、脱盐和表面活性剂的去除,即用于蛋白质溶解的十二烷基硫酸钠(SDS)。

多肽在水解和标记后,通常通过强阳离子交换层析(SCX)、亲水作用层析(ILIC)、C18或高pH反相色谱进行分级分离,可以得到至少10个组分。每个组分通常被冷冻干燥,然后用nLC-ESI-MS/MS进一步处理。相反,通过无标记方法处理的样品通常是不需要分级的,而是直接进入nLC-ESI-MS/MS系统。nLC分离多肽是在反相模式下进行的,人们通常使用水和含0.1%甲酸的乙腈分离多肽。多肽的分离既可使用等梯度的方式进行分离,也使用梯度分离。通常,样品在进样到分析柱之前先在线脱盐。洗脱后的肽随后由以数据依赖性采集(DDA)或数据非依赖性采集(DIA)模式运行的HRMS进行分析。电离是在正离子模式下的n-ESI中进行的,四极杆飞行时间(QTOF)、轨道捕捉或傅里叶变换离子回旋共振(FTICR)是较常使用的HR质谱仪。

获得的数据用专用软件进一步处理,以识别蛋白质并从统计学上突出它们的表达差异,从而发现新的生物标志物。在GDM蛋白质组学中,专有软件如Compound Discoverer、Progenis QI和ProteinPilot,通常比开源或免费软件如MaxQuant、ProteinProspector等更为普遍。这可能是因为现代仪器通常与特定应用所需的昂贵软件包一起提供。因此,运营商对使用开源软件不太感兴趣,因为在许多情况下,开源软件使用起来不太方便,并且需要将文件转换成其他文件格式。由于实验数据可以通过不同数据库(如UniProt、SwissProt和International Protein Index)进行比较,使得蛋白质的鉴定成为可能。

此外,许多研究既报道了选定的生物标志物的有效性,也报道了在独立队列中通过独立分析方法对相关诊断准确性的评估。在组学中,验证程序对于确认研究结果的可靠性、可重复性和准确性,以及证明生物标志物的适用性至关重要。为此,最常用的方法有酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western印迹分析和实时聚合酶链式反应(RT-PCR)。通过酶联免疫吸附试验和Western印迹分析的验证严格限于针对所研究样本中的靶蛋白第一抗体的商业可用性以及适当的样品制备。RT-PCR也被广泛使用,但研究结果与所研究蛋白质编码基因的转录变化有关,原则上与蛋白质丰度无关。最近,也有少量研究报道了科研人员通过靶向MRM的定量蛋白质方法进行生物标志物的分析验证。

3.1 血浆和血清蛋白组学

血浆和血清是研究最多的标本,这些样本可用于鉴定GDM的生物标志物(表1)。血液蛋白含量代表了生物体内发生的各种生物过程,并与可能的病理状态相关联。由于基质的复杂性和存在各种浓度的分析物,血浆和血清蛋白质组的分析具有挑战性。对血浆和血清的GDM研究通常与发现妊娠早期早期诊断的预测性生物标志物相关。

表1 基于质谱的GDM蛋白质组学研究总结

 表1 基于质谱的GDM蛋白质组学研究总结

缩写:AFM,afamin蛋白;ANXA2,膜联蛋白A2;ANXA4,膜联蛋白A4;ANXA5,膜联蛋白A5;APMAP,脂肪细胞质膜相关蛋白;APOE,载脂蛋白E;ARHGEF11,Rho蛋白鸟苷酸交换因子11的异构体2;CAMK2ß,钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱβ;CD36,血小板糖蛋白4;CD59,CD59糖蛋白;CETP,胆固醇酯转移蛋白;CMBL,羧甲基丁烯二肽酶同源;CNDP1,肌肽二肽酶1;CRP,C-反应蛋白;DPP-4,二肽基肽酶-4;F9,凝血因子;FCN3,纤维胶凝蛋白3;FGA,纤维蛋白原链;FIBB,纤维蛋白原转移蛋白;CMBL,羧甲基丁烯二肽酶同系物;FSH,卵泡刺激素;GST,GSH-S-转移酶;GW,孕周;HSP27,热休克蛋白27;IGFBP2,胰岛素样生长因子结合蛋白2;IGFBP 5,胰岛素样生长因子结合蛋白5;IL1RA,白介素1受体拮抗剂;LCAT,卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶;LUM,人基膜聚糖(S100A9);NDUFS3,NADH脱氢酶铁硫蛋白3;NDUFV2,NADH脱氢酶黄素蛋白2;NS,未指定;PABPC4,多聚腺苷结合蛋白4;PAPPA,pappalysin-1;PDIA3,二硫键异构酶A3;PLTP,血浆磷脂蛋白;PON1,血清对氧磷酶/芳香酯酶1;PPP3CB,钙调蛋白依赖性钙调神经磷酸酶A b;PRG2,骨髓蛋白多糖;PRX1,过氧化物还原酶-1;PRX5,过氧化物还原酶-5;PRX6,过过氧化物还原酶-6;PSG1:妊娠特异性β-1-糖蛋白4;PSMA2,蛋白酶体亚基α-1;RAP1A,Ras相关蛋白Rap-1A(0.7倍数变化);SAMP,血清淀粉样蛋白P组分;SHBG,性激素结合球蛋白;SNTA1,α-营养蛋白;TSP-4,血小板反应蛋白-4;VTN,玻连蛋白;YWHAZ,酪氨酸3/色氨酸5单加氧酶激活蛋白。

3.1.1 血浆

人们通常在妊娠11-20周时收集经EDTA处理全血后获得的血浆样本,而GDM的诊断则在妊娠24~28周进行。人们通过TMT标记和无标记方法进一步分析样品。对于TMT标记法,人们需要去除血浆样品中丰富的蛋白质,例如白蛋白和免疫球蛋白,并且在胰蛋白酶水解后,通过C18反相或通过SCX色谱法进行分级分离。在这两种情况下,人们通过基于Orbitrap的系统进行MS分析,并以DDA模式获取数据。人们对妊娠前三个月(妊娠11-13周)收集的血浆样本的研究表明,与对照组相比,GDM样本中的若干蛋白质发生了变化,这些变化与补体和凝血级联反应有关。独立队列的ELISA验证证实了GDM组中CNDP1和TSP-4的过度表达。人们将一个类似的蛋白质组工作流程应用于妊娠中期 (妊娠16-18周)收集的血浆样本,并报告了几种涉及免疫反应、炎症、转运、血小板聚集、催化和防御反应的改变的蛋白质。Western印迹分析仅适用于经蛋白质组学方法分析后的样品,并证实了与对照组相比,血浆样品中C-反应蛋白(CRP)的上调,以及其他三种蛋白的下调:性激素结合球蛋白、纤维胶凝蛋白3和妊娠特异性β-1-糖蛋白。妊娠16-18周期间收集的血浆样本也可通过无标记方法进行分析。在这种情况下,没有关于在样品采集或蛋白质耗尽后使用蛋白酶抑制剂的信息,样品只是用尿素缓冲液稀释,并用Lys-C和胰蛋白酶水解,然后以DIA模式进行基于Orbitrap的nLC-ESI-MS/MS分析。结果显示,GDM样本中有8种蛋白质浓度升高,16种蛋白质浓度降低,表明炎症系统、氧化应激、胰岛素抵抗、凝血和脂质稳态参与了GDM的发病。在一个独立的队列中,CRP的过度表达和IGFBP2的下调得到了验证,其变化通过ELISA得到了证实。

另一项研究重点关注同一妊娠期(妊娠16-20周),并用表面增强激光解吸/电离(SELDI)-MS法评估血浆蛋白质的分布。随后人们通过一维电泳和nLC-ESI QTOF-MS/MS鉴定差异蛋白。此方法报道的结果与前面提到的结果非常不同,因为与对照组相比,GDM患者血浆样本中发现的载脂蛋白CIII(APO-CIII)浓度更高;结果也得到了ELISA的验证。

人们还对脐带血浆样本,即足月采集的脐带静脉血浆进行了分析,以剖析GDM的发病机制,并评估儿童肥胖的早期标志物。这两项研究都发现,与脂质调节和运输以及葡萄糖代谢有关的蛋白质失调,这验证了GDM与晚期糖尿病和肥胖症的发展有关的假设。特别是,人们在GDM孕妇血浆中观察到胆固醇酯转移蛋白(CEPT)的表达减少和卵泡刺激素(FSH)水平的升高。与正常体重的对照组相比,肥胖的GDM患者脐静脉血浆中的磷脂酰胆碱-固醇酰基转移酶(LCAT)和磷脂转移蛋白(PLTP)显著上调,而Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子11(ARHGEF11)显著下调。

一项病例对照研究还使用无标记的DIA-MS定量方法研究了血浆外泌体,即参与胎儿与母体信息交流的血浆胞外囊泡。首先,人们用一维电泳法和nLC-ESI-QTOF-MS/MS研究差异外泌体蛋白,以产生一个局部离子数据库,用于随后对单个外泌体样品的靶向分析。人们在妊娠24周期间采集血浆样本,这些样本来自BMI值大于31的GDM患者和对照组。通过这种方法,人们可以确定GDM肥胖患者与正常血糖肥胖患者中参与能量产生、炎症、新陈代谢和胎盘脂质运输的几种差异外泌体蛋白。James-Allan等人也使用了类似的方法,他们在评估人类外泌体治疗小鼠葡萄糖稳态的影响之前,表征GDM对人类外泌体蛋白质组的影响。结果证实,注射GDM患者外泌体的小鼠胰岛素信号转导受损,胰岛素反应性减弱。

3.1.2 血清

人们通常在妊娠8-16周采集血清,通过TMT和iTRAQ标记方法确定用于GDM早期诊断的新的生物标志物。人们报道了不同的样品前处理方法。一项研究建议使用免疫亲和力耗竭来移除丰富的蛋白质,即使这种方法被认为是实验产生偏差的来源,因为一些低丰度蛋白质可能会由于非特异性的共耗竭而被去除。作者没有报告正确评估这一假设的数据,也没有任何关于可能受到这种样本处理影响的蛋白质信息,可能原因是因为优点大于风险。此外,人们还建议使用商业浓缩试剂盒预浓缩样品中的低丰度蛋白质,以避免免疫亲和力耗竭缺乏特异性。这类试剂盒是基于目标物与大量、高度多样化的多肽配体之间的亲和力相互作用。值得强调的是,在有关GDM的文献中没有关于这两种方法之间的对比分析,因此,人们很难评估哪种方法最好。

总体而言,研究结果表明,GDM的发病和发病与几种生物途径的失调有关,这些途径通常已经在血浆样本中得到验证,即补体系统、炎症和免疫反应以及凝血。人们在妊娠10-16周期间收集的GDM孕妇的血清中检测到较高浓度的载脂蛋白E(APOE)、凝血因子IX、纤维蛋白原α链(FGA)和胰岛素样生长因子结合蛋白。GDM血清样本中FGA和APOE的过度表达也得到了最近的一项独立性研究的证实,该研究反过来证实了在妊娠16-18周收集的血浆样本中CRP的过度表达。与血糖正常的肥胖者相比,人们在GDM肥胖者血清样本中发现Afamin、血清淀粉样蛋白P成分和玻连蛋白的上调。人们通过基于靶向MS的方法在由210例病例组成的队列中得到进一步验证了变化的蛋白质。在这项研究中,尽管具有统计学意义,不同组之间的浓度差异很小。

从妊娠24周采集的样本中提取的血清肽也被MALDI-MS结合弱阳离子交换磁珠评估为可能的预测性生物标志物。即使在这种情况下,FGA衍生多肽也在GDM血清中过表达,证实了FGA在GDM的发生和发展中的作用。

3.2 胎盘蛋白质组学

胎盘是与妊娠有关的最重要的器官,它的功能是通过母胎之间适当的气体、营养、废物和信号分子的交换来确保胎儿的生长发育。人们应用不同的蛋白质组学方法对胎盘组织进行了广泛的研究,目的是评估与GDM和胎盘重塑相关的生物学途径。人们通过使用凝胶的方法发现GDM损伤的胎盘中蛋白质表达情况,特别是人们用尿素缓冲液对胎盘绒毛匀浆后提取的胎盘蛋白进行了2DE分离。人们用MALDI-MS和nLC-ESI-MS/MS进一步鉴定了差异表达的电泳点。相反,以下工作是基于无凝胶的方法进行的;人们通过DDA-MSE模式获取数据,并通过nLC-ESI-MS/MS的无标记方法鉴定和定量蛋白质。研究结果表明,GDM患者体内参与调节胰岛素途径和凝血/纤溶的几种胎盘蛋白发生了改变。特别是,Western印迹分析和RT-PCR都证实,与对照组相比,胎盘绒毛组织中ANXA2、ANXA5和YWHAZ表达上调,RAP1A表达下调。人们认为这些蛋白的上调是对高血糖的反应,以维持胎盘中的纤溶平衡。这些蛋白未被无标记nLC-ESI-MSE分析证实,该分析进而报告了GDM胎盘中其他蛋白的上调(即半乳糖凝集素-1和胶原α-1[XIV]链)。必须强调的是,人们报告了在采集期间和储存前正确处理胎盘样本的重要性。当需要测定胎盘本身或胎盘亚结构的蛋白质含量时,胎盘血液含量是主要的关注点,因为高度丰富的血液蛋白质,即白蛋白和血红蛋白链,可能会造成交叉污染。因此,人们必须用非侵入性缓冲液(即PBS或等渗溶液)适当和广泛地清洗胎盘标本,以限制储存样本中的残余血量。此外,洗涤步骤应在有限的时间段内完成,不得超过30 分钟,以避免内源性蛋白酶活性导致样品的蛋白质含量发生变化。我们强烈建议使用特定的和商业上蛋白酶抑制剂混合液,但作者通常没有报告这一洗涤步骤的详细信息。

人们也研究了来自GDM孕妇和受子痫前期(PE)影响的GDM孕妇胎盘样本中的滋养层细胞,以确定可预测PE的生物标志物。不同组间差异表达的蛋白质,其中11个上调,12个下调,这些蛋白与几个生物学过程(细胞凋亡、转录调控失调、氧化应激、脂质代谢、细胞渗透和迁移以及血管生成)有关,表明GDM可能参与PE的早期发病过程。血管内皮生长因子受体(1 FLT1)和多聚腺苷结合蛋白(PABPC4)被认为是预测GDM妇女PE发病的候选生物标志物,或作为预防GDM发展为PE的干预靶点。显然,由于被分析的队列非常小,因此人们无法证实这一假设的真实性,未来需要重点研究这些蛋白质生物标志物。

人们通过一项无标记蛋白质组学研究,比较了胎龄较大(LGA)的GDM孕妇和胎龄正常(NGA)的GDM孕妇胎盘绒毛。研究发现,胎盘蛋白在GDM和LGA新生儿中发生改变。一些已鉴定的与组织分化和胎儿生长发育相关的蛋白质,即PRG2和DPP-4,被认为是未来研究的治疗靶点。关于样本选择的一些争议是不可避免的,因此,人们应该对调查结果进行批判性的评估,因为其他伴随的病理学特征并不是产生误导性信息的来源。特别是,作者将同样受肥胖影响的GDM患者的样本(BMI值 > 31)与正常体重受试者的样本进行了比较。关于GDM的LGA新生儿和对照组之间的比较分析未见报道。总而言之,目前还不清楚这些发现是否只与GDM和LGA新生儿有关。

研究人员还对脐带内皮细胞进行了分析,以评估GDM导致的氧化应激增加与T2D的发展以及母亲和胎儿晚年心血管疾病之间的联系。人们应用2DE和nLC-ESI-MS/MS对GDM患者内皮细胞蛋白质组进行了研究,重点分析了GDM患者内皮细胞蛋白质组改变的39个蛋白。调节失调的蛋白质参与氧化还原动态平衡、蛋白质氧化、DNA损伤和谷胱甘肽减少,证实GDM可能导致子代患2型糖尿病和心血管疾病的风险增加。这项研究的样本选择再次受到质疑,因为GDM患者也是肥胖的,而对照组则是正常体重的受试者。在这种情况下,研究结果与GDM和肥胖的综合影响有关,而单一病理的功能变化无法被明确。

3.3 混杂基质的蛋白质组学

在GDM条件下收集样本的蛋白质组学分析也扩展到尿液、脂肪组织、骨骼肌组织和初乳组织中。人们对妊娠早期(15-20周)采集的尿样进行分析,以确定预测GDM的非侵入性生物标志物。用丙酮沉淀蛋白质后,人们通过基于iTRAQ的方法进行分析。4个表达改变的蛋白质经ELISA验证,证实了白介素1受体拮抗剂(IL1RA)的上调表达和CD59糖蛋白(CD59)的下调。作者没有明确描述这些蛋白如何参与GDM的发生和发展,但获得的结果为提出IL1RA和CD59作为GDM的非侵入性和稳定的诊断预测指标铺平了道路,并有待后续研究进一步评估。

人们分别用无凝胶和基于凝胶的方法处理GDM期收集的脂肪组织,以确定在GDM期间参与胰岛素抵抗发展的生物学过程和确定GDM对脂肪组织蛋白质组的影响。在第一个研究中,人们通过用SDT缓冲液处理脂肪组织可以很容易地提取蛋白质,在用FASP方法水解后通过Orbitrap nLC-ESI-MS/MS分析,并鉴定出66个改变的蛋白质。Western印迹分析和免疫组化证实脂肪细胞质膜相关蛋白(APMAP)的表达下调。人们通过抑制3T3-L1脂肪细胞APMAP的表达,证实胰岛素信号转导功能受损,并评价了APMAP在GDM胰岛素抵抗中的作用。在第二项研究中,人们用2DE和MALDI-TOF-MS分析了脂肪组织,重点分析了14个差异表达的蛋白质,这些蛋白质涉及炎症、脂肪、葡萄糖代谢和氧化应激。人们再一次发现病例和对照的选择是有问题的,因为GDM患者和对照受试者都是肥胖的,此外,所有GDM患者都接受了胰岛素治疗,这可能是导致上述一些变化的原因。2DE分析仅适用于2-7 pH范围内的蛋白质。这两项研究都没有详细说明组织均质和去脂的方案。最后这一步骤是这种方法的基础,以限制分离工作流程中脂类的影响,并保持方法的重复性和可靠性。还人们应该对不同的方案进行评估,以确定实验步骤的最佳组合。

人们对GDM和NGT肥胖妇女的腹直肌骨骼肌组织进行凝胶分析,以探讨骨骼肌代谢差异与GDM发生发展之间可能存在的细胞机制。数据表明,妊娠期糖尿病与骨骼肌氧化磷酸化降低和钙稳态紊乱有关。

此外,人们采用无标记蛋白质组学方法检测了GDM对人初乳乳清部分蛋白质表达的影响。人们在产后第1~3天采集样品,用Orbitrap-Based nLC-ESI-MS/MS分析初乳中经CaCl2处理、Wessel法和Flügge法脱脂以及胰酶水解后酪蛋白的消耗情况,通过统计分析,人们鉴定出10种改变的蛋白质,提示GDM对参与免疫和营养转运的人初乳蛋白质有影响。结果并未考虑GDM患者也是肥胖体质这一影响因素。

3.4 蛋白质组学分析述评

图1报告了用于GDM研究的蛋白质组学分析的一般方法。表1也总结了本文综述的研究,并报告了相关数据,例如样本量、分析工作流程的具体信息、所使用的统计方法,以及显示进一步通过独立方法验证的差异表达蛋白质。

图1 GDM蛋白组学样品制备方案PPT,蛋白质沉淀。

图1 GDM蛋白组学样品制备方案PPT,蛋白质沉淀。

血清和血浆是GDM蛋白质组学中研究最多的基质。蛋白质组学方法和分析工作流程能够鉴定数百种蛋白质。与GDM相关的下调或上调蛋白涉及不同的机制,如炎症、氧化应激、胰岛素抵抗、凝血和脂质稳态。一些研究还证实,这些蛋白质也与母亲和围产期的短期和长期并发症有关。一般来说,不同的蛋白质组学方法也强调了不同的蛋白质种类和结果取决于研究本身。然而,在许多研究中,人们发现两种有趣的蛋白质表达上调,即CRP和FGA。与妊娠16-20周采集的对照样本相比,妊娠16-20周的GDM血浆和血清中的CRP均上调,但在妊娠11-13周期间没有异常调节。当然,我们建议进行进一步的研究来证实这一假设,并确认CRP是GDM的早期生物标志物。另一方面,FGA从妊娠8周开始在GDM血清中有较高的浓度,人们也在血清中检测到FGA衍生的多肽。即使在这种情况下,在对独立队列中更大、更有意义的患者进行适当验证后,FGA仍可被视为GDM诊断的潜在生物标志物。

蛋白质组研究非常耗时,而且通常需要昂贵的试剂,这对考虑大规模队列的可能性产生了负面影响。此外,大量样本的适当收集和储存具有挑战性,特别是在疾病诊断之前必须收集样本的情况下,例如人们发现了新的GDM生物标志物。人们通过独立方法对结果进行验证,例如应用于独立队列的酶联免疫吸附试验,通常可以缓解这一问题,并增加研究结果的可靠性。在组学方法中,病例和对照样本的正确选择是基本的,特别是对于配对比较,因为队列间的唯一变量应该是所研究的疾病存在或不存在。许多综述没有考虑这一方面,因此对所获得的研究结果的可靠性和稳健性产生了负面影响。在未来的研究中,人们应更加重视这些方面的研究,以获得潜在临床应用的相关信息,并清楚地了解与GDM密切相关的生物学过程。

综合综述研究结果,GDM的发生和发展通常会导致多种代谢途径的改变,如炎症、氧化应激、胰岛素抵抗、凝血和脂质稳态。然而,人们在不同的研究中发现了不同的蛋白质,这导致了研究的低重复性。在这种情况下,人们仍然很难提出用于GDM预测和诊断以及监测不良结果的可靠蛋白质生物标志物。

4. 基于MS的GDM代谢组学研究

代谢组学是对生物液、细胞或组织中的低分子产物进行彻底和系统的分析,这些产物起源于生物体在特定时间点和特定病理生理条件下发生的各种生化和代谢途径。近年来,靶向和非靶向代谢组学方法使得人们在流行病学和分层医学研究中发现大量的生物标志物、促使人们鉴定不同基质中的数千种代谢物以及扩大关于表型指纹图谱的知识。代谢生物标志物与环境或化学刺激引起的生理状态、基因表达和其他生物机制的变化直接相关,从而提高疾病预后和诊断的结果。尽管代谢组学是一个相对较新的研究领域,但人们已经发表了大量关于监测不同样本中的不同代谢物用于治疗目的和疾病相关调查的研究。除了蛋白质组学,人们在与GDM相关的代谢组学研究中也提出了一种对比性方法,即鉴定在病理发生或发展过程中表现出表达变化的代谢物。

MS与LC、气相色谱(GC)或毛细管电泳联用(CE)的可能性组合为高通量分析显示多种化学性质的分子铺平了道路。MS的高选择性和高灵敏度对于代谢物鉴定至关重要,因此MS慢慢地盖过了NMR的作用。

人们在靶向研究中通常采用基于三重四极杆(QqQ)的GC-MS和LC-MS平台,而在非靶向研究中广泛使用基于QTOF或Orbitrap的LC-MS/MS仪器。靶向分析通常由市场上可获得的代谢物鉴定和定量试剂盒辅助,因此,这些论文中只报道了很少关于分析方法的开发和验证的信息。LC分离通常利用的是反相相互作用原理,尽管HILIC有时用于优化小分子和强极性分子的分离或检测。GC分析通常在衍生化和适当的样品提取后进行的。

代谢组学通常避免复杂和耗时的样品制备过程。蛋白质沉淀通常是在碱性或酸性条件下用不同的溶剂组合(即甲醇或乙腈)进行的前处理,然后在受控温度或真空条件下进行超速离心和溶剂蒸发。通常样品的浓缩和纯化步骤有助于在低浓度范围内分析物的测定和基质效应的减少。人们很少报道固相萃取法,并且固相萃取法只应用于目标化合物的分析,即胆汁酸。然而,选择合适的方法取决于分析物和样品。一般来说,尿液、血清、血浆和羊水只是通过蛋白质沉淀和稀释来处理,而更复杂的基质,如胎盘需要更复杂的准备步骤。样品的正确储存也是一个主要问题,人们必须在分析前彻底考虑样品的完整性和稳定性。一般而言,样品应在−80°C下短期保存。对于蛋白质组学来说,人们必须对大量数据进行统计评估,以提取有关研究样本中可能发生的代谢物变化的信息。市面上有各种各样的软件包,如Compound Discoverer、Progenesis QI等等,还有许多免费或开放源码的工具,如XCMS平台。多元统计技术和几种分类方法,即PCA,PLS,PLS-DA 和OPLS-DA,通常用于减少变量数量和突出潜在的生物标志物,以及用于结果的验证。

非靶向代谢组学的另一个关键和具有挑战性的任务是代谢物的注释。代谢组学标准计划(MSI)的化学分析工作组(CAWG)确定了四种不同水平的代谢物识别置信度:确认已识别的化合物(1级)、推断已注释的化合物(2级)、推断已注释的化合物类别(3级)和未知化合物(4级)。指南评估应清楚地报告所描述的所有代谢物的鉴定水平。

大多数研究报告的代谢物已经被鉴定和很好地表征,可归因于水平1。因此,非新发现的代谢物是通过比较单一的化学参数与真实样品或化学参考标准品来鉴定的,但必须提供足够的信息,即水平1的最低标准。对于非代谢物的验证,人们需要至少两个在相同实验条件下获得的独立的正交数据,即LC或GC-MS分析的保留时间或保留指数、MS/MS光谱的准确质量或同位素图谱的准确质量。更高的可信度要求需要与公共或专有数据库进行谱图匹配,以及用于明确代谢物鉴定的额外正交数据,例如关于立体构型、选择性提取过程、二极管阵列光谱、选择性衍生化和同位素标记的信息。较低级别的鉴定是根据实验的物理化学性质或光谱相似性与开源谱图库进行比较而不使用化学参考标准品(第2级),或基于与特定化学类别的已知分子的光谱相似性(第3级)。未鉴定或未分类的代谢物可以通过光谱数据区分进而归为第 4 级。

5. 基于质谱学的金属组学在GDM中的应用

代谢组学和蛋白质组学是基于有机分子含量的图谱分析技术,而金属组学侧重于细胞、组织或生物液的无机成分的分析,以及确定由于疾病发生或通过食物或环境接触无机物质而可能发生的变化。

已知某些元素在很大程度上参与了人体内发生的生理过程的改变,GDM的发生和发展已经与高金属水平的暴露有关。其他研究强调了金属和GDM风险因素之间的联系。大多数研究仅限于少数几种目标元素,因为是用原子吸收光谱(AAS)进行分析的,因此人们无法获得所考虑样品的全部无机含量。最近的研究是基于电感耦合等离子体质谱(ICP-MS),ICP-MS能够获取被研究样品的元素指纹,并提高了灵敏度和检测下限,从而为金属组学铺平了道路。然而,与GDM相关的金属组学研究仅限于文献当中,通常集中在血液、胎盘和胎粪中的靶向元素分析。

尽管元素是已知的,而且与有机分子相比其数量有限,但样品制备仍然是金属组学中的关键一步,特别是在测定痕量分析物和去除污染方面。通用的样品制备方法如图3所示。通常,人们通过添加浓硝酸来溶解大多数基质干扰,然后添加过氧化氢和在不同温度下水解,样品随即被矿化。微波消解通常是为了减少消解时间和提高过程温度。最后,人们通常需要通过稀释来调整硝酸浓度。表3详细描述了实验相关细节。

图2 GDM金属组学的样品制备方案UPW,超纯水

图2 GDM金属组学的样品制备方案UPW,超纯水

表3 电感耦合等离子体质谱在GDM金属组学研究中的应用

表3 电感耦合等离子体质谱在GDM金属组学研究中的应用

缩写:GDM,妊娠糖尿病;GW,孕周;ICP-MS,电感耦合等离子体质谱。

最早确定GDM发生与GDM和NGT孕妇妊娠24-28周非肝素化血样元素组成之间关系的研究之一是由Caglar等人进行的。Caglar等人通过ICP-MS评价硼的效果。这一元素参与甘油三酯和葡萄糖的动态平衡,并可能在几种酶系统中作为代谢调节因子。人们将结果与以前通过比色分析获得的数据进行了比较,报告了MS测量在灵敏度、定量限、批间和批内变异性(RSD分别为3.22%和1.66%)方面的显著改善。最近的一项研究还报告了怀孕早期的血清铊浓度与GDM风险以及孕前较高的BMI呈正相关,且与年龄相关。这项研究招募了3013名怀孕三个月的妇女,其中383人随后被诊断为GDM。血清分析是通过ICP-MS进行的,但关于样品制备的其他细节没有明确的报道。在这种情况下,人们不清楚变量之间的正确关系,因为众所周知,受试者的BMI和年龄越高GDM发病率越高,但作者没有报告GDM发病率与铊血液浓度关系的信息,因此不可能得出GDM差异影响因素的结论。

母婴环境化学物质研究(MIREC)报告了有关砷、铅、镉和汞的数据。这项调查是对怀孕前三个月采集的孕妇全血进行的,以评估这些因素作为GDM危险因素的作用。同样在这种情况下,人们没有报告样品制备方法的具体细节。数据的Logistic回归分析表明,人体暴露于As后,与GDM相关的风险显著增加,并呈现剂量依赖性反应。即使在对几个GDM影响因素进行总体调整后,结果仍显著。

在一项招募了776名受试者的病例对照研究中,人们还通过另一种靶向性方法分析了母亲的血液,以确定镍、砷、镉、锑、铊、汞和铅的水平,并强调这些元素可能与患GDM风险相关。母体暴露于镍、铅、砷和汞可能是GDM发病的危险因素,不同的金属有不同的统计学意义。然而,队列的选择尚不清楚,因为作者没有报告采集样本的确切孕周。这对于评估金属作为GDM风险因素的作用或作为评估GDM效应的探针是非常重要的。

Zheng等人重点研究了妊娠早期晚期收集的血浆中的锌、硒、铜和钼,以强调其与血糖水平的可能相关性。据报道,铜和血糖水平呈正相关,而血浆钼水平与血糖水平呈负相关。这是为了强调GDM患者的数量与对照组的数量不匹配,从而对统计分析和最终考虑的稳健性产生负面影响。Onat等人最近报告了一项类似的研究,其中通过一种经验证的ICP-MS靶向方法对GDM病例对照研究中112名受试者血清中的重金属和微量元素成分进行了定量。作者证明,胰岛素抵抗与血清中较高水平的镉、钯、锑、汞、砷、铬、锌、铜和硒相关。作者还认为金属可能参与机体的炎症和氧化应激反应。

Peng、Zhang等人研究了孕期接触重金属引发GDM的可能风险,分析了新生儿胎粪中的目标金属,这些金属可作为一种全新的非侵入性基质。病例对照研究的受试者数量包括137 名 GDM 孕妇和 190 名对照。人们将胎粪样品冷冻干燥,并在100°C下用浓硝酸和30%过氧化氢消化5 h。即使胎粪的金属成分和母亲在怀孕期间暴露于金属残留物之间的关系没有明确描述,但考虑到基质的复杂性,因此所报道的方法在灵敏度和回收率方面的表现对Cr、as、Cd、Hg和Pb来说是极具参考价值的。作者总结说,在二元logistic回归中,较高水平的三种重金属(As、Cd和Cr)与GDM的患病率相关,该研究校正了六个影响因素,即母亲年龄、妊娠BMI、妊娠次数、产次、乙肝感染和新生儿性别。

值得注意的是,在对妊娠第20周收集的尿液样本进行的研究中,尿液样本在注射到ICP-MS系统之前被简单地离心(15分钟,5000 rpm)并用2.0% v/v的硝酸稀释10倍。该研究涵盖了2090名受试者,其中241名被诊断为GDM,揭示了镍、砷、钴、锑和钒与该疾病的发病率呈正相关,这可能表明妊娠早期金属暴露与GDM风险具有相关性。

除了上述对血浆、血清和尿液的靶向研究之外,人们还进行了非靶向金属组学方法来鉴定许多生物流体和组织中的金属或其他元素。上述分析之间的主要差异与选择胎盘而不是血液作为基质有关。考虑到这些因素,人们从有限数量的GDM和NTG孕妇中收集胎盘样本,并用浓硝酸进行处理。人们通过使用金属同位素作为内标来监控仪器的灵敏度和准确度,以防止仪器漂移。人们通过PCA方法进行的数据分析确定了硒和镉水平与GDM发病之间的负相关关系。另一项研究是对胎盘、全血和脐带血进行的,旨在确定与GDM的发展和流行相关的因素。在这种情况下,人们提出了采集胎盘样本的替代方法,以在储存和水解前去除残留血液。特别是,人们将分娩后的胎盘样品用NaCl溶液彻底清洗,然后将胎盘分离成两种不同的解剖成分,即母体和胎儿,冷冻干燥并通过硝酸矿化。全血样品用硝酸简单消化。进行统计分析时,人们还考虑了登记的受试者在怀孕前和怀孕期间的饮食情况,还考虑了含有矿物质的膳食补充剂的消耗,以评估GDM和样品元素组成之间的相关性中混杂因素的存在。胎盘样本和母血的结果显示,母血和胎盘元素组成的个体间差异很大,这使得GDM的区分存在困难。相反,本研究显示了全脐带血在区分来自GDM母亲和健康受试者的胎儿中的关键作用。胎儿血液中的钙、铜、铁、钾、锰、钠、磷、铷、硫、硅和锌的浓度与病理显著相关,表明由于GDM的发展,这些元素穿过胎盘的转运机制受损。

5.1 金属组学分析的述评

GDM的金属组学研究仍是一个未被探索的领域。关于重金属在血液和尿液中分布的一些靶向性研究已有报道,但“组学”方法仅限于靶向和非靶向这两项研究。要强调的是,由于元素周期表中的元素数目有限,“非靶向”一词不能完全适用于金属组学,但一般方法可与其他组学研究相媲美。此外,考虑到用于ICP-MS的多组分标准品的大量可及性,以及获取大多数已知元素的定量或半定量信息的可能性,人们强烈建议采用非靶向的方法。

样品制备程序通常简单快捷,特别是当样品用微波法消化时。因此,金属组学研究通常呈现出更可靠的统计数据。在分析过程中,人们应通过注入空白样品和质量控制,对仪器漂移进行准确和仔细的监测,就像其他基因组方法一样。结果表明,最终的统计分析需要使用与参与者的生活方式有关的数据,即饮食、工作类型、膳食补充剂的消费、吸烟、是否存在伴随的疾病等。这些信息对于突出共生因素和防止数据解释失败是至关重要的。

6、结论

在过去的十年中,人们报告了各种基于组学的研究,以确定参与 GDM 发病和进展的生物学机制。在这种情况下,MS通过解开分子在这个复杂但组织良好的系统中的定性和定量作用,从大蛋白质到小代谢物,启发了人们对不同生物机制和各种代谢途径中涉及的整个化学指纹的探索。每种方法的主要优点和/或缺点列表如下:

1.基于凝胶或无凝胶方法(无标记或标记方法)的蛋白质组学研究通常在有限数量的样本上进行。在未来的研究中,人们应改进患者样本的选择,因为在许多情况下,其他病理即肥胖,并没有被考虑在内。

2.人们对在不同孕期收集的各种生物标本进行了靶向和非靶向代谢组学研究,但未测试独立队列研究结果的可重复性。氨基酸、游离脂肪酸和磷脂酰胆碱是主要的差异代谢物,但结果及其可靠性尚未验证。人们仍不可能提出一组分子用作生物标志物,也不可能用于GDM诊断,也不可能评估潜在的负面长期效应和负面结果。

3.金属组学在GDM仍是一个未开发的领域。人们报告了许多靶向性研究,但结论与受试者的选择不一致。非靶向性研究仅限于胎盘和全血,但人们强调了一些有待证实的问题,如胎盘组织中转运机制的损伤。

许多生物标志物已被提出用于早期诊断和预测不良的产后结果在 gdm。尽管付出了很多努力,但是临床常规的高灵敏度、选择性和稳定性的标记物还没有被发现,或者至少没有得到充分的验证和测试。以目前的技术水平,在这方面取得进一步的进展当然是有可能的。需要评估和协调研究,以收集重要的,可重复的和可比较的数据。因此,迫切需要标准的操作程序。此外,生物标志物应该在更大的队列中进行彻底验证,以获得临床意义。多中心研究的出现可能是一个转折点。

原文链接:

https://doi.org/10.1002/mas.21777


(声明:本网所转载的文章内容仅作为信息资源提供与分享,并不意味着代表本站观点或证实其内容的真实性,不用于或依赖于任何诊断或治疗目的,此信息不应替代专业诊断或治疗,如有不希望被转载的媒体或个人可与我们联系,我们将立即进行删除处理!)

加载中~
加入收藏 ()
分享
加载中~