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数字PCR仪最新应用与进展

发布:大分子生物 阅读量: 行研报告 2022-06-20

数字 PCR( Digital PCR,dPCR)是继实时荧光定量 PCR( Real-time quantitative PCR,qPCR) 之后发展的高灵敏核酸绝对定量分析技术,通过把反应体系均分到大量独立的微反应单元中进行 PCR 扩增,并根据泊松分布和阳性比例来计算核酸拷贝数实现定量分析。与传统 PCR 技术相比,数字 PCR 技术不依赖于标准曲线,具有更高灵敏度、准确度及高耐受性,可实现对样品的绝对定量分析。近年来,随着微流控技术日臻成熟,基于微流控技术的数字 PCR 技术得到了快速的发展,在基因突变检测、拷贝数变异检测、病毒微生物检测、转基因食品检测以及测序等方面均得到广泛的应用。

本文整理了近期数字PCR相关最新研究进展,如想阅读更多信息,欢迎持续关注大分子生物医药网哦,我们将为您更新更多实时的资讯内容。

数字PCR仪最新应用与进展(图1)

一、研究进展

1.1 Anal.Chem丨基于数字PCR技术的脊髓性肌萎缩症(SMA)精准检测方法

2022年2月10日,清华大学医学院郭永团队与北京大学第一医院、首都医科大学附属北京妇产医院合作,在国际著名学术期刊《分析化学》(Analytical Chemistry)发表了题为“用于脊髓性肌肉萎缩症分子诊断和疾病严重程度评估的单管多重数字聚合酶链式反应检测方法”(Single-Tube Multiplex Digital Polymerase Chain Reaction Assay for Molecular Diagnosis and Prediction of Severity of Spinal Muscular Atrophy) 的文章,并被选为杂志封面。

脊髓性肌萎缩症(Spinal muscular atrophy,SMA)是儿童最常见的遗传性神经肌肉病,目前用于SMA相关基因检测和拷贝数确定的方法复杂、耗时或无法同时检测多个靶标。

该研究建立了一种基于数字PCR单管检测SMN1外显子7和8、SMN2外显子7和8及内参基因的方法,通过数字PCR技术绝对定量目标基因和内参基因的模板拷贝数,计算目标基因与内参基因模板拷贝数的比值来实现目标基因拷贝数的检测。研究团队以不同的荧光染料标记5个基因的探针,并配合新羿生物的5色微液滴数字PCR系统进行检测,实现了5个基因单管检测。该检测方法具有检测准确、检测快速、操作简单、检测限低和适用于多种类型样本的优势,为SMA分子诊断、大规模筛查和疾病严重程度评估提供了一个有力的工具。

参考文献:https://view.inews.qq.com/a/20220212A02YYW00

1.2 遗传疾病筛查新技术 | 数字PCR实现高灵敏无创产前筛查

数字PCR在单基因病的检测中得到了广泛应用,例如已知父母基因型的胎儿地中海贫血检测(β-地中海贫血病(HBB基因)[5],α(0)-地中海贫血病(SEA等位基因)),镰状细胞病,已知父母基因型的胎儿遗传性耳聋基因检测(孟德尔相关遗传疾病)等。

目前,商品化的NIPT试剂盒仅能检测非整倍体、小缺失和插入以及一些引起遗传疾病的父系遗传的单基因点突变遗传疾病,而不能检测到母系遗传的单基因点突变疾病。Elisabetta D’Aversa等报道了基于微滴数字PCR (ddPCR)的检测技术,通过胎儿基因分型来识别母系和/或父系遗传的两种最常见的β地中海贫血突变(β+IVSI-110 and β039)。通过对扩增效率和杂交特异性方面进行优化,应用这两种dPCR检测方法测定52例不同胎龄孕妇血浆样本的胎儿基因型。所有标本均经DNA测序证实诊断结果。在遗传自母亲或父母双方的突变情况下,需要精确定量正常和突变等位基因来确定胎儿的基因型。研究确定的等位基因比率值的两个诊断范围,具有统计学差异且不重叠,允许对几乎所有分析样本进行正确的胎儿基因型测定。开发出了一种基于dPCR的简单、敏感的诊断方法,用于父系遗传的β+IVSI-110和β039突变的NIPT,并首次用于母系遗传的其他单点突变,该技术可能适用或推广至引起单基因疾病的其他单点突变 。

参考文献:D'Aversa, E., et al., Droplet Digital PCR for Non-Invasive Prenatal Detection of Fetal Single-Gene Point Mutations in Maternal Plasma. Int J Mol Sci, 2022. 23(5).

1.3 数字PCR在废水新冠病毒检测中的应用

Johannes Ho等在一年内(2020年6月至2021年7月)使用数字PCR技术测定德国西南部卡尔斯鲁厄市废水处理厂原废水中SARS-CoV-2浓度,比较区域内SARS-CoV-2浓度与报告的COVID-19病例,发现显著相关性。将感染数曲线前移16天,发现趋势基本一致。将废水中SARS-CoV-2浓度与感染数进行比对,线性系数R2为0.91,表明以废水为基础的流行病学作为早期预警系统的潜力。

Matthew T. Flood等对比荧光PCR和数字PCR检测废水处理厂的废水和废水管道上游的废水中SARS-CoV-2病毒3个遗传标记(N1、N2和E),发现废水中SARS-CoV-2病毒含量较低,而E基因拷贝数基本低于荧光PCR检测下限,而数字PCR用于不同废水基质中SARS-CoV-2基因标志物的绝对定量则具有更高的敏感性和准确性,且重复性远高于荧光PCR。

Diana M. Toledo等监测2020年9月底至2021年2月初美国新罕布什尔州和佛蒙特州的9个城市废水设施收集的样本中的SARS-CoV-2病毒浓度。部分城市数据显示,废水中的SARS-CoV-2阳性峰值比COVID-19活跃病例数提前7天。对比废水中SARS-CoV-2遗传标记N1和N2检测结果,表明在稀释样本中数字PCR的阳性检出率明显高于荧光PCR,且线性相关系数也优于荧光PCR。

利用废水流行病学研究病毒传播预警、指示疫情变化趋势时,检测方法更注重废水中低浓度病毒RNA的检出敏感性;而用于确定感染者数量或比例时,则更注重废水中病毒RNA的定量数据。利用数字PCR技术检测废水中SARS-CoV-2主要应用于:疾病预防控制中心,公共卫生机构,环境监测/环保部门,城市废水处理系统等,无论是检测敏感性及定量准确性,数字PCR技术的优势都能得到完整的体现。

数据来源:https://mp.weixin.qq.com/s/vf5WGrJvuuaO_2xGD3OlNw

1.4 数字 PCR 检测 CSF 中 MyD88 L265P 基因突变作为诊断原发性 CNS 淋巴瘤的分子指标

原发性中枢神经系统淋巴瘤(primary centralnervous system lymphoma,PCNSL)是一种原发于脑、脊髓、软脑膜和眼的罕见侵袭性结外淋巴瘤。PCNSL高侵袭、病程进展较快且预后差。未经治疗患者中位生存期约为 1.5~3.0 个月,以大剂量甲氨蝶呤为基础的综合化疗可使患者中位生存期达到 40~60 个月,而复发难治较为常见,其总体预后更差,中位生存期仅有4~12个月。因此早诊断、早治疗是改善预后的关键因素。

本研究收集了复旦大学附属华山医院北院就诊的PCNSL患者39例作为研究对象。分别利用流式细胞术检测IL-10、数字 PCR 检测 MyD88L265P 平台建立和验证分析以及脑组织和脑脊液中检测MyD88。

实验结果显示,对中枢神经系统肿瘤微创性诊断来说,脑脊液液体活检相对血浆或血清标本更加适合用于中枢神经系统肿瘤的诊断。数字 PCR 检测已知分子靶点具有高灵敏度等优势,用数字 PCR 检测脑脊液MyD88L265P 突变可作为诊断肿瘤分子指标。联合脑脊液细胞学、细胞因子及流式细胞学可以提高诊断 PCNSL 的效能。在 PCNS 患者中出现眼内累及和脑脊液 MyD88L265P突变是不良的预后因素,检测脑脊液 MyD88L265P 突变有希望成为肿瘤微残留的监测指标。

参考数据:陈锟,马晶晶,王迪,李向宇,秦欢欢,林之光,马燕,陈波斌,关明.脑脊液MyD88L265P基因突变对原发性中枢神经系统淋巴瘤预后的影响[J].中华检验医学杂志,2022,45(01):51-57.

二、重大活动

2.1 迈克生物:猴痘病毒检测产品获得欧盟CE准入资质

5月27日丨迈克生物公布,公司的猴痘病毒检测产品于近日获得欧盟CE准入资质,产品名称:猴痘病毒核酸检测试剂盒(荧光PCR法)、猴痘病毒核酸检测试剂盒(数字PCR法)。预期用途:用于猴痘病毒的体外检测。

猴痘病毒核酸检测试剂盒(荧光PCR法)和猴痘病毒核酸检测试剂盒(数字PCR法)适用于鼻拭子、咽拭子、血液及皮损渗出液等样本,灵敏度高、特异性强,可快速准确检出病毒特异性基因片段,实现猴痘病毒感染的早期诊断。猴痘病毒核酸检测试剂盒(数字PCR法)可进一步检测低浓度样本,且与天花病毒、牛痘病毒、痘苗病毒等无交叉,大大助力猴痘病毒的精准诊断与预防。

参考文献:http://stock.hexun.com/2022-05-27/206036724.html

2.2 微滴式数字PCR技术写入《血液培养技术用于血流感染诊断临床实践专家共识》

《血液培养技术用于血流感染诊断临床实践专家共识》于2022年2月19日发布。

分析中检测---检验流程

建议微生物学实验室根据自身条件决策和建立快速鉴定方法(如质谱)和直接药敏试验。建议整合实验室自动化资源向临床提供一份含初步鉴定结果及直接药敏结果的二级报告。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix‑assisted laser desorption ionization‑time‑of‑flight mass spectrometry,MALDI‑TOFMS)、单靶标聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)、多重PCR、微滴式数字PCR技术等可在3h内完成培养液直接鉴定。

检验时长(turnaround time,TAT)是从血培养标本采集到临床医师接收报告的时间,建议微生物学实验室按照下列规定落实TAT要求。缩短TAT有助于快速诊断、规范临床抗微生物药物使用,并减少住院时间,改善患者预后。建议微生物学实验室和各相关方协同优化,缩短TAT。血培养检验时长要求:(1)分析前标本采集到孵育:≤2h。特殊情况如夜班时,室温放置不超过4h。(2)分析中:①革兰染色:≤1h;②快速抗原反应:≤2h;③分子生物学:当天出结果。

分析中问题处理

血培养假阳性和假阴性的处理血培养是定性试验,存在假阴性和假阳性。同时血培养又有其特殊性,包括培养瓶转运和上机时间、染色背景和病原体染色特点、培养条件等都可能影响涂片和培养的检出率。实验室人员务必仔细观察培养瓶和生长曲线,增加染色方法和特殊培养条件,必要时进行相关抗原、抗体或分子生物学检测等,并注意记录和总结,持续提高处理问题的能力。

人型支原体可致产后脓毒症,肺炎支原体也可引起血流感染,其他像立克次体、巴通体、柯科斯体等常规革兰染色均不易着色,需结合患者因素和临床特征,以及相关免疫学和分子生物学检测结果。

涂片可见菌体但培养无生长的情况,首先要考虑优化培养基、培养条件,调整培养时间等(包括上面点种的情况)。少数微生物有抗原检测,如肺炎链球菌、新型隐球菌、淋病奈瑟菌等。另外可以考虑分子生物学检测方法,如针对细菌16SrRNA、针对真菌内部转录间隔区等进行广谱PCR检测。

分析后相关工作和结果解释---

结果的不确定性和矛盾性

血培养阴性,但临床怀疑仍有病原菌感染时,建议重复送检血培养,并采取替代检测方法。如考虑是病毒血症或苛养微生物时,可采用免疫学检测、分子生物学检测等方法直接检测血液样本。

参考数据:https://mp.weixin.qq.com/s/GTWaJvZ-ckFtEcCcgmV0yA

2.3 国家药监局对PCR、质谱、液相色谱等27类医疗器械涉及《医疗器械分类目录》内容进行调整

2022年3月30日,国家药监局发布了关于调整《医疗器械分类目录》部分内容的公告(2022年第30号),对27类医疗器械涉及《医疗器械分类目录》内容进行调整。此番调整涉及PCR仪、微生物质谱鉴定系统、质谱检测系统、液相色谱分析仪器等。

针对核酸扩增分析仪器,可以看到本次没有对该仪器的产品类别进行调整(仍隶属临床检验器械-分子生物学分析设备-核酸扩增分析仪器),管理类别依旧是Ⅲ类,但对产品描述、品类举例均进行了新增补充。

新增产品描述:

通常由样本核酸分配体系或模块、扩增模块、信号采集分析模块、软件、电源部件等组成。样本核酸分配体系或模块采用的原理主要为通过微流控芯片或形成微小液滴的方式达到模板单分子分配,从而进行单独、平行的 PCR 反应。扩增模块原理则和核酸扩增仪器一致。信号采集分析模块原理一般为通过采集荧光信号的有无判定单个反应体系中模板分子的存在,进行检测分析。

凭借检测灵敏度高、定量结果更准确、更直观等多项优势,数字PCR技术被认为是分子诊断领域未来最关键的技术平台之一,是当下的热门创业方向和投资热点。近几年,多款国产数字PCR产品获得药监局批准,让这一领域热度再次攀升。

近两年数字PCR赛道的国产品牌相继宣布有单笔过亿元融资,新羿生物、领航基因、思纳福医疗等均是其中佼佼者。相信在资本市场的加持下,国产数字PCR品牌将会进一步提升研发实力,扩大市场份额。同时,我们也期待临床数字PCR在未来发挥更大的作用。

数据来源:https://www.instrument.com.cn/news/20130425/611219.shtml

三、新技术介绍

3.1 PNAS:我国科学家研发出高阶多重实时荧光PCR检测技术

实时荧光PCR技术是目前应用最为广泛的核酸检测技术。然而,由于主流荧光PCR仪器检测通道数目的限制,单个反应所能检测的靶基因数目很难超过6个,限制了该技术在检测涉及多靶点的复杂疾病上的应用。

厦门大学研究团队在《美国国家科学院院刊》(PNAS)杂志上发表了题为“Highly multiplex PCR assays by coupling the 5’-flap endonuclease activity of Taq DNA polymerase and molecular beacon reporters”的文章,研发出了一种称为“MeltArray”的荧光PCR新技术,将荧光PCR的单管检测能力提高了至少一个数量级。

该技术利用了荧光PCR反应中Taq DNA聚合酶的5‘-瓣状内切酶活性,将位于引物下游的“媒介探针”切割,释放出“媒介引物”,“媒介引物”结合到反应体系中的分子信标报告探针上。在Taq酶聚合活性作用下,“媒介引物”沿着分子信标延伸,生成具有特定熔点值的荧光双链。由于每个分子信标可以允许多个“媒介引物”形成一系列具有不同熔点值的荧光双链,单个MeltArray多重荧光PCR反应可检测的总靶基因数目就等于反应中分子信标数量乘以其所容纳的“媒介引物”数量。研究团队实现了单个荧光通道可检测12个靶标,6个荧光通道的仪器可检测72个靶标,这是单个闭管实时荧光PCR一步法目前所能检测的最大靶基因数量。

该研究证实了MeltArray多重荧光PCR技术在不改变现有仪器设备的情况,在遗传病、传染病和肿瘤的分子诊断上都有良好灵敏度和特异性,成功推动荧光PCR这一“老技术”再上“新台阶”,填补了长期存在于低阶PCR和高通量检测二者之间的技术空白。

数据来源:https://news.bioon.com/article/fdc7e2317757.html

3.2 原创数字PCR振动微滴技术发明人杜文斌教授首次技术揭秘

2022年1月,,数字PCR振动微滴技术发明人中国科学院微生物研究所杜文斌教授在国际分析化学主流期刊Analytical Chemistry发表了题为“OsciDrop: A versatile deterministic droplet generator”的期刊内封面文章,首次向公众揭示了振动微滴技术(OsciDrop)的力学模型和多重体积数字PCR研究成果。

数字PCR作为当下最灵敏的核酸检测技术,在分子诊断领域备受瞩目。振动微滴技术是杜文斌教授原创的、拥有自主知识产权的数字PCR微滴生成技术路线,具有以下三大优势:

可靠性:创新不对称振动技术,实现基于高韦伯数的微滴生成新机制,液滴体积控制更精准;

低成本:采用低成本注塑加样吸头,免除昂贵芯片耗材,显著降低液滴制备成本;

自动化:以自动化代替手动操作,一体化的使用体验满足客户便捷操作需求

振动微滴技术巧妙地利用高频不对称振动,将加样吸头中排出的样本液体在油相中切割为均一的皮升至纳升体积的微滴。通过力学模型分析发现,振动微滴法生成液滴时,韦伯数(Webers number, We, 惯性力和表面张力之比)的贡献比毛细管数高两个数量级以上。因此,振动微滴技术是一种依托于全新韦伯数主导的可控液滴生成机制。

数字PCR的定量范围受微滴数量限制,定量范围的提高往往以成倍增加的液滴数和读取时间为代价;检测动态范围低于荧光定量PCR,限制了数字PCR在病毒载量检测等领域应用的普适性。在上述力学模型基础上,杜文斌教授利用优化的微滴生成条件,实现了200皮升到2微升横跨5个数量级的微滴制备,人基因组DNA检测的线性范围横跨6个数量级。值得一提的是,该方法仅用注塑加样吸头即可灵活实现微滴体积控制,不需要使用微加工芯片耗材,极大的降低了数字PCR的使用成本。

数据来源:https://view.inews.qq.com/a/20220128A01JCU00

四、项目介绍

4.1 苏州医工所周连群团队在芯片式数字PCR检测技术和仪器研制方面取得系列进展

苏州医工所周连群课题组聚焦生物传感器领域,深耕十余年,在生物传感方法开发、生物芯片设计加工、生命科学仪器研制等方面积累了坚实基础。在数字PCR研发方面,基于隔离稳定性高、温度均匀性好、检测速度快的芯片式数字PCR(cdPCR)方法,自主研发了高通量数字化芯片及高通量数字化核酸分析仪,围绕高通量数字化核酸检测方法、芯片、试剂和仪器等方面取得了一系列重要进展。

在高通量数字化芯片的加工与改性方面,周连群课题组的李金泽、邱亚军等人在Analyst上发表题为Heterogeneous modification of through-hole microwell chips for ultralow cross-contamination digital polymerase chain reaction的论文,提出了针对数字化芯片三维异质性改性的新策略,通过内壁亲水、表面疏水的异质性化学改性,实现了高填孔率、低残留的数字化样品分割。通过深硅刻蚀可以得到高密度蜂窝状微孔阵列,如何保证待测生物样本能高效的填充入微孔,并且降低液体在表面残留导致的孔间连通,是数字化样品分割的关键。针对该问题科研人员提出了对于均质硅材料的三维异质性改性策略,即通过微接触印刷只在特定的空间位置发生化学修饰,进而在均质材料的三维空间上形成具有不同化学性质的界面。通过工艺优化消除了样本挥发导致的扩散效应,实现了芯片表面的选择性疏水修饰。三维异质性改性后的芯片可以达到91%以上的填孔率以及小于5%的液体残留率,优于商业化的数字PCR芯片。利用该芯片可以实现高效准确的dPCR检测,定量结果的线性相关性达到0.999以上。该核心技术的突破为自研cdPCR的精准定量奠定了坚实基础。

在样本的数字化分配与封装方面,周连群课题组的高旭等人在Biomicrofluidics上发表题为High filling rate digital PCR through-hole array chip with double independent S-shaped flow channels的论文,提出了针对数字化芯片的微流控进样封装方法,通过双S型流道夹心数字化芯片的结构,有效提高的样品的填孔率和装载重复性。传统的刷样方式,受限于操作的繁琐性,存在耗时长、重复性差、易污染的问题,限制了芯片式数字PCR的应用。通过微流控结合标准化仪器设备,可以实现进样封装的标准化和自动化,简化用户的手动操作步骤和整体样品装载和封装时间。本文主要通过流体力学仿真结合试验验证,解决了流体样本与微孔相互作用过程中的稳定性、均匀性和重复性问题,通过合理的结构设计和优化的进样条件,实现了填孔率大于99%、填孔液体体积CV达6%的高效、高均匀性进样与封装。该成果的突破有效提升了自研cdPCR的易用性,为产品的临床应用推广奠定了良好基础。

芯片式数字化核酸检测的应用方面,周连群课题组与华山医院检验医学科关明课题组合作在Sensors & Actuators: B. Chemical(中科院I区)上联合发表题为Establishment of scalable nanoliter digital LAMP technology for the quantitative detection of multiple myeloproliferative neoplasm molecular markers的论文,对骨髓增殖性肿瘤(MPN)的多重标志物实现了超敏、多靶标、定量检测,从而为这种罕见病的早期诊断和靶向治疗提供新的方法。Ph染色体(费城染色体)阴性的经典骨髓增殖性肿瘤是以一系或多系分化相对成熟的骨髓造血干细胞持续克隆性增殖为特征的恶性血液疾病。随着分子生物学技术的迅速发展,越来越多的分子标志物被不断发现。根据世界卫生组织(WHO)最新的骨髓增殖性肿瘤诊断标准,JAK2、MPL 和CALR三个基因的突变已被作为骨髓增殖性肿瘤诊断的重要参考指标。周连群研究员课题组与关明教授课题组“医-工”结合,将环介导等温扩增(LAMP)技术快速等温扩增的优势、微流控技术高通量的优势和数字PCR技术准确定量的优势进行整合,成功开发了一款数字LAMP检测平台,并基于纳米粒子的特殊功能,对现有的LAMP检测体系进行了改良,可在60分钟内实现骨髓增殖性肿瘤CALR-1、CALR-2和JAK2 V617F分子标志物的准确定量检测,检测灵敏度分别为0.5%、0.1%和0.5%突变水平。与现有的商业化数字PCR平台相比,本项目开发的数字LAMP平台具有检测成本低、检测速度快等优势,具有良好的应用前景。

数据来源:https://www.instrument.com.cn/news/20220418/613077.shtml


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