一、寡核苷酸分析策略

1.1寡核苷酸的定义及分类

寡核苷酸是以mRNA为靶点的短RNA或DNA序列及其类似物。它们是根据致病基因的碱基序列设计的。通过影响mRNA的转录，它们可以减少致病蛋白质的表达或恢复蛋白质的表达，从而在疾病的治疗中发挥作用

有几种寡核苷酸药物：ASO(反义寡核苷酸)、siRNA(小干扰RNA)、miRNA(microRNA)，适体(aptamer)

已批准上市的15种寡核苷酸药物中，大多数是Aso，只有适体和四种siRNA(其中三种由GalNAc修饰)。在pk/tk分析手段的选择上，约有一半的药物选择基于液相色谱的分析平台，对定量下限的要求一般为1-10ng/ml。那么生物分析在寡核苷酸药物的开发中起到什么作用呢?如何选择分析平台?

1.2寡核苷酸生物分析

寡核苷酸药物研发的生物分析部分需要回答四类问题，包括：药物及其代谢物分析、免疫原性分析、免疫毒性评估和疗效检测(图1)。无锡apptec全球生物分析团队建立的完整的生物分析平台可以用来回答这些问题。在药代动力学和毒代动力学方面，已经建立了四个检测平台：lc fld(液相荧光平台)、lc ms/ms(液相质谱平台)、混合ELISA(混合酶联免疫吸附试验平台)和PCR(聚合酶链反应)。分析平台可根据寡核苷酸的类型和大小、灵敏度和特异性要求以及分析通量进行选择(图2)[1]

图1. 寡核苷酸药物研发的四大检测范围及分析平台

图2. 分析平台灵敏度与寡核苷酸大小的关系

对于寡核苷酸药物，在各种生物基质中药物浓度的测量、代谢物的鉴定和定量是关键的初始步骤，可以为PK和TK的评估以及代谢途径的阐明提供必要的信息。而大量内源性的相似DNA和RNA的存在，以及寡核苷酸和其代谢物的相似性，给生物分析方法的建立带来了很大挑战[2]。对于寡核苷酸及其代谢物的分析，更需要一个稳健的、选择性高的、灵敏度高的生物分析方法。

寡核苷酸的PK和TK评估，目前主流的分析方法是LC-MS/MS，LC-FLD作为补充，因为其他方法(LC-FLD, Hybrid ELISA, qPCR)多是利用碱基互补配对原则，探针一般为比待测序列短或长的寡核苷酸链，不能很好的区别母药和丢失GalNAc的代谢物。以目前研究热门的GalNAc-siRNA为例，这一类药物代谢物丰富，所以往往需要排除代谢物在检测过程中对母药的影响，由于部分代谢物的量超过母药的10%，且具有一定的药物活性，还需要根据实际情况进行评估代谢物浓度。本期主要介绍LC-MS/MS平台和LC-FLD平台的寡核苷酸生物分析策略。

二、LC-MS/MS平台对寡核苷酸的血浆和组织进行生物分析

LC-MS/MS平台可以很好的实现寡核苷酸在血浆和组织中的药物浓度分析，寡核苷酸药物由于其骨架上的磷酸酯结构，决定了其易于形成多电荷的负离子，在ESI源负离子模式下响应较好，同时也因为容易结合金属离子，从而分散质谱信号。经过前处理的样本会在液相上面实现分离，将待测物和杂质分离开来，然后进入质谱中离子化，按照离子的质荷比再次筛选。因此LC-MS/MS在寡核苷酸药物的代谢物定量分析上较其他平台拥有很大的优势。除了选择性，还有多通道检测，同时检测反义链(AS), 正义链(SS)和代谢产物也是LC-MS/MS的一大优势。

2.1样品前处理方式选择

对血浆和组织样本进行前处理时，液液萃取和固相萃取两种方式比较常见，液液萃取常见溶剂为苯酚、氯仿，成本低，操作简便，但不是每种寡核苷酸都能提取出来，另外它处理后的样本中杂质含量较多。固相萃取是通过离子交换的方式将待测物和杂质分离洗脱出来，成本高，操作复杂，但处理出来的样本比较干净，对色谱柱更友好，还可对样本进行浓缩，提高灵敏度(图3)。

图3. 固液萃取原理

2.2流动相该如何选择

寡核苷酸的结构决定了其极性非常强，很难保留在传统的反相色谱柱上。HILIC模式或离子对试剂可用于在反相色谱柱上实现保留。烷基胺等分子具有疏水尾和带正电头。疏水尾杆与色谱柱结合，通过静电作用保留带正电荷的头和寡核苷酸。因此，通常将烷基胺作为离子对试剂添加到流动相中以实现保留。六氟异丙醇是弱酸，可以调节流动相的pH值，改善峰的形状和保留。通常与烷基胺结合使用，但在质谱电离过程中会引起离子抑制。因此，在使用时，应综合考虑该方法的色谱性能和灵敏度。

三、LC-FLD平台对寡核苷酸的血浆和组织样本生物分析

荧光检测原理是将两条RNA链脱旋，其中待测链与带有荧光基团的PNA(肽核酸)探针结合。PNA是DNA类似物，用多肽骨架取代磷酸主链。由于PNA不带负电，并且与DNA和RNA没有静电排斥，结合的稳定性和特异性大大提高(图4)。基于互补碱基配对原理的荧光检测方法的选择性比质谱法低，但荧光检测的优点是其灵敏度可以比质谱法高10倍。由于需要液相分离以实现其选择性和分离干扰或代谢物，荧光分析通常比质谱分析花费更长的时间。

图4. 荧光检测的原理

参考文献

[1] Bioanalysis (2016) 8(2), 143–155

[2] Bioanalysis (2019) 11(21), 1967–1981

[3] Bioanalysis (2019) 11(21), 1941–1954