题目：偶联阴离子交换色谱法与天然质谱法表征单克隆抗体的电荷异质性

文章名称：Coupling Anion Exchange Chromatography with Native Mass Spectrometry for Charge Heterogeneity Characterization of Monoclonal Antibodies

期刊：analytical chemistry

发表日期：2021- 10

Abstract:

Despite the recent success of coupling anion exchange chromatography with native mass spectrometry (AEX-MS) to study anionic proteins, the utility of AEX-MS methods in therapeutic monoclonal antibody (mAb) characterization has been limited. In this work, we developed and optimized a salt gradient-based AEX-MS method and explored its utility in charge variant analysis of therapeutic mAbs. We demonstrated that, although the developed AEX-MS method is less useful for IgG1 molecules that have higher isoelectric points (pIs), it is an attractive alternative for charge variant analysis of IgG4 molecules. By elevating the column temperature and lowering the mAb pI through PNGase F-mediated deglycosylation, the chromatographical resolution from AEX separation can be significantly improved. We also demonstrated that, after PNGase F and IdeS digestion, the AEX-MS method exhibited excellent resolving power for multiple attributes in the IgG4 Fc region, including unprocessed C-terminal Lys, N-glycosylation occupancy, and several conserved Fc deamidations, making it ideally suited for multiple attribute monitoring (MAM). Through fractionation and peptide mapping analysis, we also demonstrated that the developed AEX-MS method can provide site-specific and isoform-resolved separation of Fc deamidation products, allowing rapid and artifact-free quantitation of these modifications without performing bottom-up analysis.

电荷异质性通常由翻译后修饰引起，被认为是治疗性单克隆抗体(maabs)的一个关键质量属性，因此，需要在整个药物开发阶段进行彻底的表征和监测。了解单抗电荷异质性的生化根本原因不仅对OOS (OOT)或OOS (OOS)调查非常重要，而且还为风险评估和工艺改进提供了框架，基于质谱(MS)的工具在这项任务中发挥了关键作用。

在本研究中，作者开发并优化了基于盐梯度的AEX-MS方法，并探索其在治疗性单抗电荷异质性表征中的应用。在方法开发过程中，作者评估了不同的洗脱模式、柱操作温度和样品处理方法以提高色谱分辨率。同时还测试了多种pi范围广泛的单抗分子，包括IgG1和IgG4亚类，以评估该方法的适用性。研究发现，经过PNGase F和IdeS酶切后，所建立的天然AEX-MS方法对IgG4 Fc区域的多个属性显示了良好的分辨能力。该方法可以解析位点特异性的Fc脱酰胺变体，以及脱酰胺化异构体(Asp vs isoAsp)，通过AEX馏分的肽图分析进一步证实了这一点。

1. AEX MS法柱温的优化

在柱温分别为25、35、45℃的条件下，用AEX-MS对pI = 6.6的单抗a分子和pI = 6.8的单抗b分子进行检测，研究其对单抗滞留分离的影响。对盐梯度CEX法的研究表明，较低的柱温比较高的柱温更有利于单抗的分离，表现出稍高的峰容量。在AEX方法中，随着柱温从25°C升高到45°C，这两种单抗分子均表现出显著改善的变异分离，以及更尖锐的峰(图1)。由于45°C条件下色谱分辨率的提高，两种单克隆抗体的碱性和酸性变体都可以容易地识别和定量。因此，选择柱温为45℃进行完整单抗的AEX-MS分析。

图1. (a) mAb-A (pI= 6.6) 和 (b) mAb-B (pI = 6.8) 在柱温 25 °C（蓝色迹线）、35 °C（橙色迹线）下的天然 AEX-MS 分析的 TIC 迹线 ) 和 45 °C（红色迹线）

2. AEX-MS方法适用性评价

对7个单克隆抗体(IgG1和IgG4子类)和NISTmAb (pi为6.1 - 9.2)进行天然的AEX-MS分析，生成的总离子色谱图(TICs)如图2所示，每个分离的变异峰都根据准确的质量测量和经验知识进行了标记和识别，并且较低pI的单抗分子获得了更好的变异分离。两个基于IgG1的单克隆抗体，mAb-7和NISTmAb，具有较差的保留和分辨率。相比之下，所有6种基于IgG4的单克隆抗体(mAb-1到mAb-6)都获得了良好的分离，pI值相对较低。mAb-6的pI高于流动相的pH值，但仍然实现了良好的分离，这表明是表面电荷决定了AEX的分离。总的来说，虽然已开发的天然AEX-MS方法不适用于高pi的IgG1分子，但它广泛适用于中等pi的IgG4基子，并且与其他方法相比具有一些独特的选择性。

图2. (a) 来自不同 mAb 分子（5 μg 注射）的天然 AEX-MS 分析的 TIC 迹线，pI 值范围为 6.1 至 9.2。(b) TIC 轨迹的放大视图显示在右侧。电荷变体峰表示如下：M，主峰；A、酸性；B，基本的。

3. CEX-MS与AEX-MS方法的比较

为了证明开发的AEX-MS方法在这些场景中的实用性，使用CEX-MS（图3a）和AEX-MS方法（图3b）分析了一个pI=6.8的基于IgG4的单克隆抗体分子。根据CEX-MS分析，两个酸性峰（A1和A2）均显示出广泛的洗脱，分别被确定为脱酰胺和糖化变体。对同一单克隆抗体的AEX-MS分析很容易分辨出四种基本变异体，包括含有1或2种未加工C端赖氨酸的单克隆抗体物种，以及部分和非糖基化的单克隆抗体物种。对于基于IgG4的单克隆抗体分子，AEX-MS方法比CEX-MS方法表现出更好的变体分离，从而实现更灵敏和可靠的电荷异质性表征。因此，对于pIs较低且CEX不能很好分离的单克隆抗体分子，AEX-MS方法可能是一种有吸引力的替代方法。

图3. IgG4单抗（a）CEX-TIC和（b）AEX-TIC的比较

4. PNGase f介导的去糖基化提高AEX-MS分辨率

在对AEX-MS方法的适宜性进行评价时，发现低pI的单抗分子可以获得更好的AEX分离。作者在PNGase F处理前后分别对三种单抗分子(pI = 6.5的mAb-3、pI = 6.6的mAb-4和pI = 6.9的mAb-8)进行了AEX-MS分析，得到的总离子色谱图(TICs)如图4所示。经PNGase F处理后，所有三种单抗分子的AEX保留量都显著提高，证实了由Asn到Asp转换导致的酸度增加。此外，在处理后，所有三个分子的峰锐度和变异分离都取得了显著的改善。即使在去除Fcn -聚糖后， AEX-MS方法仍然可以有效地表征Fcn -糖基化的宏观异质性。因此，PNGase f介导的去糖基化是提高AEX-MS色谱性能的有效途径。

图4. PNGase F处理之前（蓝色虚线痕迹）和之后（黑色实线痕迹）对（a）mAb-3、（b）mAb-4和（c）mAb-8进行的天然AEX-MS分析中的TIC痕迹

在本研究中，作者报道了一种Native的AEX-MS方法的开发和优化，并评估了其在单抗电荷变异分析中的应用。对于CEX不能很好分离的mAb分子，AEX-MS方法是一个很好的选择。除了常见的电荷变异，该方法对Fcn-糖基化宏观异质性和位点特异性脱酰胺引起的变异特别敏感。AEX-MS方法广泛适用于基于IgG4的单克隆抗体，随着基于IgG4的治疗方法的不断发展，这种已开发的AEX-MS方法作为一种提供全面电荷异质性表征的替代手段将变得越来越有价值。

Liu, Anita P., et al. "Coupling Anion Exchange Chromatography with Native Mass Spectrometry for Charge Heterogeneity Characterization of Monoclonal Antibodies." Analytical chemistry (2022).