题目：

Guiding-Strand-Controlled DNA Nucleases with Enhanced Specificity and Tunable Kinetics for DNA Mutation Detection

期刊：

Analytical Chemistry(IF=6.98)

发文日期：

2021

研究机构：

华中科技大学同济医学院生殖健康研究所

研究背景

核酸酶是各种生物医学应用中的强大工具，例如基因工程、生物传感和分子诊断。然而，常用的核酸酶(核酸内切酶IV、无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶1和λ核酸外切酶)容易对单链DNA进行非特异性切割，使得所需反应的产率极低且不可预测。

研究思路

为了寻找能降低核酸酶对ssDNA非特异性切割的方法，作者首先用dsDNA对核酸酶非特异性切割ssDNA抑制效果进行了荧光实验，然后用LSPR实验探索了dsDNA抑制核酸酶非特异性切割的机制。

根据核酸酶非特异性切割ssDNA的作用机制，作者开发了引导链辅助酶/探针DNA突变检测系统。并用荧光实验验证了对野生型和突变目标链的检测效果。然后检测了该系统在癌症病人中的DNA突变检测效果。还深入研究了Endo IV、APE-1和λ exo在ssDNA和dsDNA存在下的工作机制，构建了理论模型。

研究结果

荧光实验表明dsDNA能有效抑制核酸酶对ssDNA的非特异性切割。LSPR实验结果核酸酶与dsDNA的KD为4nM，与ssDNA的KD为11nM，该亲和力实验结果表明核酸酶与dsDNA的亲和力远大于ssDNA，这解释了为什么dsDNA能显著抑制核酸酶对ssDNA的非特异性切割。

根据dsDNA显著抑制核酸酶ssDNA非特异性切割是由于dsDNA与核酸酶亲和力大于ssDNA的原因，作者在进行目标链突变检测过程中在突变位点前后设计了引导链与目标链构成双链，设计了引导链辅助酶/探针检测系统。对野生和突变目标链进行检测，结果引导链能极大降低非特异性切割，且对突变检测没有大的影响。卵巢癌病人DNA突变检出率达到0.01%，而不加引导链系统检出率为1%。作者还构建了理论模型来准确预测酶的切割率，定性和定量地解决了DNA探针测定中非特异性。

研究结论

与不加引导链的酶/探针检测系统相比，作者开发的引导链辅助酶/探针检测系统显著降低非特异性信号，同时保持对靶链的高酶活性，这会大大降低优化成本及提供更稳定的性能，并且构建了一个可以定量预测核酸酶切割率的数学模型。LSPR技术在探究核酸酶与ssDNA和dsDNA的作用机制中，提供了亲和力数据，直接定量揭示了核酸酶在ssDNA和dsDNA上分布差异，为后续引导链辅助酶/探针检测系统开发提供了有利证据。

LSPR技术无需任何标记即可实时和快速检测两个分子间能否结合、结合方式、结合过程(kon,koff)和结合强度(KD)以及结合量(浓度检测)。基于LSPR技术的OpenSPR具有检测灵敏度高和仪器成本低、较低的芯片使用和维护成本、以及仪器使用简单的特点。可用于抗原-抗体、蛋白-蛋白，蛋白-多肽，蛋白-小分子，蛋白-核酸，核酸-小分子等分子间的亲和力检测，并兼容纳米颗粒，病毒样颗粒，血清血浆，细胞等粗提样本的分子互作研究。