原标题：Proteomic evaluation of human osteoblast responses to titanium implants over time

发表期刊：Journal of Biomedical Materials Research

发表日期：2022.08.30

研究领域：蛋白质组学

技术平台：液相质谱(Evosep One、Bruker timsTOF Pro with PASEF)

样本：人成骨细胞

钛具有良好的生物相容性和骨整合能力，被广泛应用于骨假体。为了了解喷砂酸蚀(SAE)钛种植体对人成骨细胞(HOB)生物学反应的影响，采用LC-MS/MS分析了其蛋白质组的特征。将植入材料与细胞共同培养，在1、3、7天的标本中检测到2544个差异蛋白质。用Perseus软件进行蛋白质组学数据的比较分析。SAE-Ti组与未加钛组相比，eIF2、mTOR、胰岛素分泌和IGF信号通路相关蛋白的表达差异有统计学意义。此外，用SAE-Ti获得的蛋白质组图谱随着时间的推移进行了比较。受影响的蛋白质与黏附、免疫、氧化应激、凝血、血管生成、成骨和细胞外基质形成功能有关。体外观察SAE-Ti对成骨细胞增殖、矿化和成骨基因表达的影响。结果表明，该材料可提高成骨细胞的矿化率，增加其对Coli、RUNX2、SP7、CTNNB1、CAD13、IGF2、MAPK2和mTOR的表达。总体而言，观察到的蛋白质组图谱可以解释SAE-Ti的成骨特性，拓宽了我们对参与这种类型种植体骨整合过程早期阶段的关键信号通路的了解。

将纯化后的200 ng样本加载到Evosep One色谱仪(Evosep BiosSystems，丹麦),与Bruker timsTOF Pro质谱连用。采用Evosep 30SPD(44 min/样)，质谱使用标准1.1s周期时间采集模式在DDA模式下运行。

结果1：HOb蛋白质组分析

用MaxQuant包对裂解的HOB细胞在SAE-Ti和C上培养的蛋白质进行鉴定和定量。在样本中鉴定出2,544种不同的蛋白质。Perseus对在SAE-Ti上培养的成骨细胞的蛋白质组结果进行了分析。随着时间的推移表达的上调和下调蛋白的数量，这一比较分析揭示了这一点。培养1d后，有616个蛋白质有差异表达。3天和7天后，分别鉴定出221和413个这样的蛋白质。对7天的培养进行类似的比较，发现了755个差异表达的蛋白质(115个上调，640个下调)。

结果2：差异蛋白质的功能分类：SAE-Ti与C

采用Panther分类系统对差异表达的蛋白质进行分析，并检测相关功能。与SAE-Ti(与C相比)培养的HOB细胞差异表达的蛋白质相关的分子和生物学功能如图1和图2所示。分子功能的Panther饼图显示大多数差异表达的蛋白质主要与催化活性、结合活性和转运蛋白活性有关。

图1：SAE-Ti培养的HOB细胞与C培养的HOB细胞差异表达蛋白的分子功能饼图

图2显示了在整个培养时间内差异表达蛋白质的生物学功能的Panther饼状图。在这一排名中，研究条件下最突出的生物功能与细胞和代谢过程、生物调节、定位和对刺激的反应有关。在较小程度上，与多细胞生物体过程、运动、信号和发育过程相关的蛋白质也被鉴定出来。

图2：与C相比在SAE-Ti上培养的HOB细胞中差异表达蛋白相关的生物学功能的饼图

使用IPA生物信息学工具在第1、3和7天获得富含检测到的差异表达蛋白(SAE-Tivs.C)的途径(图3)。68条途径被识别并分类为四种可能的途径：黏附与增殖、成骨、免疫与氧化应激、凝血与血管生成。IPA分子活性预测工具预测了与SAE-Ti与C比较中检测到的差异表达蛋白质相关的上游分子(表S3)。

图3：在IPA分析中获得的富集化途径的分布。

在图4中，作为示例显示了允许IPA预测RICTOR激活的关系。COL5A1和MAP4K4的差异激活(SAE-Ti和C)在第1天也被预测。在成骨中起关键作用的RUNX2、Wnt3a和COL5A1蛋白在SAE-Ti的长期培养中被预测显著激活。

图4：用IPA上游调节工具预测RICTOR激活。

结果3：SAE-Ti差异蛋白随时间变化的功能分类

对在SAE-Ti上培养的HOB细胞不同时期差异表达的蛋白质的Panther分析如图5所示。结合、催化活性、分子功能调节、转运蛋白、结构分子、分子接头和翻译调节活性是检测到的蛋白质的分子功能，与培养第1天相比，第3天和第7天的表达水平发生了变化。随着培养时间的延长，与催化活性功能相关的蛋白质比例逐渐增加。在这项分析中，差异下调的蛋白质在第1天比第3天和第7天更丰富。这些蛋白的表达在培养3天和7天后发生了变化，这些蛋白具有多种生物学功能。这些是细胞、免疫系统和发育过程、定位、运动、代谢和多细胞生物过程、对刺激的反应、信号、生物黏附和生物调节功能(包括上调和下调的蛋白质)。

图5：在SAE-Ti上培养的HOB细胞不同时期差异表达的蛋白质的Panther图

使用STRING软件获得了随时间差异上调的HOB蛋白的相互作用网络。已确定的关系如图6所示。网络中的蛋白质还与细胞外基质组织、成骨细胞分化、骨骼系统发育和成骨功能有关，以及含有胶原的细胞外基质蛋白类型。

图6：与第1天的蛋白质组表达相比，培养3天(A)和7天(B)的HOb细胞中上调的差异蛋白之间的STRING相互作用网络。

深入研究生物材料对成骨细胞相关再生机制的影响，对于了解种植体周围的骨愈合过程具有重要意义。蛋白质组学结果表明，SAE-Ti不仅影响整合素的激活，而且还影响细胞与ECM以及eIF2、mTOR和IGF之间的中介信号，在成骨细胞的增殖和分化中具有重要作用。对不同孵育期后获得的SAE-Ti样品的蛋白质组学特征进行比较，可以确定HOB暴露于该生物材料引起的细胞机制随时间的变化。在随时间差异上调的蛋白质中，发现了一组与骨骼系统发育有关的蛋白质。血栓蛋白、胶原蛋白、RBP4、IGF2、Gas6、TNC、MAP2K2、FGF1和EphA2的表达增加，在成骨和ECM形成中起关键作用，可以解释SAE-Ti相关的成骨，提高了这种材料对细胞机制影响的了解。

Romero‐Gavilán F, Cerqueira A, García‐Arnáez I, et al. Proteomic evaluation of human osteoblast responses to titanium implants over time[J]. Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2022, 111(1): 45-59.https://doi.org/10.1002/jbm.a.37444