摘要：酶联免疫试剂盒可以快速检测多个细菌培养液中的卡那霉素含量。我们用卡那霉素检测试剂盒对筛查抗性细菌的培养液进行样本处理，免疫反应，上机检测，最后计算得到检测结果。发现酶联免疫试剂盒能够准确检测细菌培养液中的卡那霉素含量，线性系数99%，回收率92%，平行性变异系数5%。

关键词：卡那霉素 酶联免疫 定量检测

目前检测卡那霉素的方法有微生物法，HPLC，液质法，免疫法等1，但是微生物法培养时间很长，色谱质谱法程序复杂，过柱一次只能测一个样品，不适合大量样品筛查,免疫胶体金法只能做到半定量2。所以我们选择用酶联免疫法来检测培养液里的卡那霉素，能进行样品的筛查和定量检测。

在筛选卡那霉素抗性质粒的时候，需要往细菌培养液中加入卡那霉素，抗性质粒带有抗性基因，可使宿主菌对卡那霉素产生抗性，培养后活着的细菌就含有抗性质粒，培养此细菌再经过分离得到抗性质粒3。为了测试培养液中的卡那霉素含量，我们使用卡那霉素检测试剂盒来进行测试，希望可以寻找到一种测试细菌培养液中卡那霉素的好方法，并在生物医药研发和食品分析行业得到运用。

REAGEN品牌的卡那霉素酶联免疫反应试剂盒基于竞争性酶联反应原理，抗原已经包被于微孔板上。分析时，样品、酶标物以及抗体加入孔中，如果样品中含有卡那霉素，会与微孔板上的抗原竞争抗体，同时酶标物与抗体结合。加入TMB底物，底物的颜色显色强度与样品中卡那霉素的含量成反比。

样本处理过程:

细胞裂解液/培养液/质粒

（1） 取100mL培养液样本，加900mL 1×样品稀释液，涡流震荡混匀；

（2） 离心5分钟，4000×g；

（3） 每孔取50mL上清液来检测。

稀释倍数:10

酶联免疫反应步骤：

（1） 加入50mL的标准品于所设定的微孔中；

（2） 加入50mL的样品于所设定的微孔中；

（3） 按顺序在每孔中加入50mL HRP酶标二抗和50mL一抗，轻敲微孔板边缘混匀

30秒；

（4） 室温（22.5±2.5）°C避光孵育30分钟；

（5） 洗板4次，每次应该加入250mL 1×洗液，最后一次使板尽量甩干并在吸水纸上拍干；

（6） 加入100mL的TMB底物；计时，轻敲微孔板边缘混匀30秒；

（7） 在室温（22.5±2.5）

°C避光孵育15分钟，加入100mL的终止液终止反应；

（8） 用酶标仪在450nm下读吸光度值 (读数前，最好用无绒布擦拭除去微孔底部的水分和指痕)。

结果计算:使用双对数曲线作图,即是Log/Log标曲看线性和结果。

标准曲线吸光度表

卡那霉素试剂盒标准曲线图：

回收率测试：往菌培养液里添加卡那霉素至浓度2ppb和另外一个浓度25ppb，重复测试3次得到结果如下： 

数据分析：通过上述实验和数据，发现，卡那霉素检测试剂盒的曲线线性系数达到99.59%,标准品和样品的变异系数都小于5%,测试细菌培养液的回收率在90-110%之内,说明此方法适合检测这种样品。

总结：现在生物医疗和生物制药都是国家政策支持的热门行业，大量的生物工程样品和工程菌表达的产物都需要检测抗生素残留，为了找到合适的检测方法，我们经过多次测试，发现卡那霉素酶联免疫试剂盒刚好能应用在此领域，发挥快速和定量检测的功能。

参考文献：

[1]周勤华，张毅，杨胜利.一种新的卡那霉素残留检测方法[J]，中国生物工程杂志,2005,25(3):84-90

[2]武晋孝.王成.牛奶中氨基糖苷类药物残留胶体金免疫层析技术研究[J].中国饲料,2017,(6):24-29.

[3]杨汉春，陈艳红，查振林，地高辛标记质粒探针监测卡那霉素耐药性的研究，[J]中国农业科学，2001,（1）77-80