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酶联免疫试剂盒检测细菌培养液中的卡那霉素

发布:barneychen 阅读量: 免疫学 2022-11-14

摘要:酶联免疫试剂盒可以快速检测多个细菌培养液中的卡那霉素含量。我们用卡那霉素检测试剂盒对筛查抗性细菌的培养液进行样本处理,免疫反应,上机检测,最后计算得到检测结果。发现酶联免疫试剂盒能够准确检测细菌培养液中的卡那霉素含量,线性系数99%,回收率92%,平行性变异系数5%。

关键词:卡那霉素 酶联免疫 定量检测

目前检测卡那霉素的方法有微生物法,HPLC,液质法,免疫法等1,但是微生物法培养时间很长,色谱质谱法程序复杂,过柱一次只能测一个样品,不适合大量样品筛查,免疫胶体金法只能做到半定量2。所以我们选择用酶联免疫法来检测培养液里的卡那霉素,能进行样品的筛查和定量检测。

在筛选卡那霉素抗性质粒的时候,需要往细菌培养液中加入卡那霉素,抗性质粒带有抗性基因,可使宿主菌对卡那霉素产生抗性,培养后活着的细菌就含有抗性质粒,培养此细菌再经过分离得到抗性质粒3。为了测试培养液中的卡那霉素含量,我们使用卡那霉素检测试剂盒来进行测试,希望可以寻找到一种测试细菌培养液中卡那霉素的好方法,并在生物医药研发和食品分析行业得到运用。

REAGEN品牌的卡那霉素酶联免疫反应试剂盒基于竞争性酶联反应原理,抗原已经包被于微孔板上。分析时,样品、酶标物以及抗体加入孔中,如果样品中含有卡那霉素,会与微孔板上的抗原竞争抗体,同时酶标物与抗体结合。加入TMB底物,底物的颜色显色强度与样品中卡那霉素的含量成反比。

样本处理过程:

细胞裂解液/培养液/质粒

(1) 取100mL培养液样本,加900mL 1×样品稀释液,涡流震荡混匀;

(2) 离心5分钟,4000×g;

(3) 每孔取50mL上清液来检测。

稀释倍数:10

酶联免疫反应步骤:

(1) 加入50mL的标准品于所设定的微孔中;

(2) 加入50mL的样品于所设定的微孔中;

(3) 按顺序在每孔中加入50mL HRP酶标二抗和50mL一抗,轻敲微孔板边缘混匀

30秒;

(4) 室温(22.5±2.5)°C避光孵育30分钟;

(5) 洗板4次,每次应该加入250mL 1×洗液,最后一次使板尽量甩干并在吸水纸上拍干;

(6) 加入100mL的TMB底物;计时,轻敲微孔板边缘混匀30秒;

(7) 在室温(22.5±2.5)

°C避光孵育15分钟,加入100mL的终止液终止反应;

(8) 用酶标仪在450nm下读吸光度值 (读数前,最好用无绒布擦拭除去微孔底部的水分和指痕)。

结果计算:使用双对数曲线作图,即是Log/Log标曲看线性和结果。

标准曲线吸光度表

标准品浓度

吸光度 #1

吸光度 #2

吸光度#3

平均吸光度

标准差

变异系数%

0ppb

1.979

1.970

1.980

1.976

0.006

0.279

0.2 ppb

1.859

1.756

1.840

1.818

0.055

3.014

0.6 ppb

1.614

1.580

1.595

1.596

0.017

1.067

1.8 ppb

1.213

1.215

1.200

1.209

0.008

0.673

5.4 ppb

0.855

0.846

0.853

0.851

0.005

0.555

16.2 ppb

0.492

0.485

0.495

0.491

0.005

1.046

卡那霉素试剂盒标准曲线图:

酶联免疫试剂盒检测细菌培养液中的卡那霉素(图1)


回收率测试:往菌培养液里添加卡那霉素至浓度2ppb和另外一个浓度25ppb,重复测试3次得到结果如下: 

序号

编号

结果

2ppb

25ppb

1

1

1.89

24.8

2

1.87

26.6

3

2.01

25.6

2

1

1.96

25.7

2

1.85

25.8

3

2.05

25.5

平均(ppb)

1.94

25.7

标准差

0.074

0.53

变异系数

3.8

2.1

回收率(%)

97.0

102.8

数据分析:通过上述实验和数据,发现,卡那霉素检测试剂盒的曲线线性系数达到99.59%,标准品和样品的变异系数都小于5%,测试细菌培养液的回收率在90-110%之内,说明此方法适合检测这种样品。

总结:现在生物医疗和生物制药都是国家政策支持的热门行业,大量的生物工程样品和工程菌表达的产物都需要检测抗生素残留,为了找到合适的检测方法,我们经过多次测试,发现卡那霉素酶联免疫试剂盒刚好能应用在此领域,发挥快速和定量检测的功能。

参考文献:

[1]周勤华,张毅,杨胜利.一种新的卡那霉素残留检测方法[J],中国生物工程杂志,2005,25(3):84-90

[2]武晋孝.王成.牛奶中氨基糖苷类药物残留胶体金免疫层析技术研究[J].中国饲料,2017,(6):24-29.

[3]杨汉春,陈艳红,查振林,地高辛标记质粒探针监测卡那霉素耐药性的研究,[J]中国农业科学,2001,(1)77-80


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