本文介绍了Alto在T细胞重定向免疫治疗领域的应用，本次实验使用Alto检测了Immunocore公司开发的8个双特异性ImmTAC®分子与pHLA蛋白的亲和动力学数据，测量结果跨越5个数量级，与传统SPR测量结果一致。

双特异性抗体(以下简称双抗)可结合两个不同的抗原或同一抗原上的两个不同表位，比单抗具有更好的治疗效果，因此被广泛研究用于治疗广泛的疾病，又被称为下一代最有潜力的癌症免疫治疗手段。

过去20年中，包括博纳吐单抗(blinatumomab)和艾美赛珠单抗(emicizumab)在内，全球有5种双特异性抗体( BsAb )药物获得了市场批准，而临床在研究中的数百种双抗药物。此外，除了癌症治疗，双抗在慢性炎症性疾病、自身免疫、神经变性、出血性疾病和感染等适应症中也被评估为潜在治疗选择。

在治疗学中，双抗的靶点作用机制可以分为四类，分别为细胞桥接、双靶点阻断、双免疫细胞靶点强化协同、促蛋白复合体生成。目前双抗在研产品以细胞桥接作用机制最为热门，即双抗靶向T细胞受体( TCR )，进而将T细胞与肿瘤抗原联连接起来。双抗的一个臂靶向肿瘤特异性抗原，如肽- HLA (也称为主要组织相容性复合体( MHC ))I分子)，同时另一个臂连接T细胞受体如CD3e，可通过桥接目标细胞和T细胞，形成免疫突触，诱导T细胞活化并释放细胞毒性蛋白，从而裂解目标细胞。

Immunocore公司专注于T细胞受体(TCR)疗法的开发，专有技术平台ImmTAXTM开发新型双特异性分子。利用ImmTAXTM平台开发出的双特异性生物制剂ImmTAC分子，由工程化改造的TCR与抗CD3的单链抗体片段( scFv )两部分组成，如图1。

图1：ImmTAC分子结构图

基于单抗的肿瘤免疫疗法仅限于靶向细胞表面蛋白或分泌蛋白，而通过整合高特异性结合的TCR，ImmTAX分子可识别由人类白细胞抗原( HLA )呈递的细胞内癌症或病毒抗原，具有超高亲和力和选择性，并通过抗CD3免疫激活效应功能重定向免疫系统杀死这些癌症和/或感染细胞 (图2 )。Immuncore目前正在使用ImmTAX技术来针对广泛的适应症，有望克服天然免疫系统和目前的治疗方法的局限性。

Alto是基于数字微流控( DMF )技术的高通量SPR检测平台，在双抗的SPR表征中，Alto与传统SPR相比具有很多优势，如：Alto无流路系统，代之以DMF技术精确控制纳升级别的纳米液滴;可运行复杂的实验方案;样本仅需2uL,相比于传统SPR减少了200倍;此外，Alto的16个独立通道可同时分析多个双抗，实现了完全自动化，减少了手动操作时间。

图2：重定向溶解肿瘤细胞示意图

(ImmTAC分子桥联T-细胞受体和肿瘤特特异性配体pHLA，桥联后释放毒性蛋白，导致肿瘤细胞凋亡)

体外表征潜在治疗候选分子的亲和力和动力学对于确保这些分子在的高度特异性至关重要。在这一应用中，Alto检测了8种双特异性抗体亲和力和动力学数据，验证了它们不同的TCR靶向能力。同时本次使用了传统SPR方法进行了平行实验，并将Alto的检测结果与传统SPR进行了对比，证明了Alto在检测双抗的亲和力和动力学方面的适用性。

仪器型号：ALTO16

卡盒：CBX羧基卡盒KIN-CART-CBX-16

缓冲液：PBST，链霉亲和素偶联试剂盒

配体：pHLA蛋白

分析物：双特异性抗体(8个不同的ImmTAC分子)

方法：单循环动力学SCK，1：1动力学模型

使用Alto进行pHLA配体与8个双抗的SPR结合实验，结合曲线如图A-H。

图A-H:1-8ImmTAC分析物与配体蛋白pHLA的结合解离曲线

Alto与传统SPR仪器检测结果如表1所示，除分析物1外，其他分析物与pHLA配体的结合模型符合1：1的结合动力学模型。

表1 : 1-8ImmTAC分析物与配体蛋白亲和动力学检测数据

(Alto与传统SPR对比)

Alto与传统SPR亲和动力学检测数值之间的差异百分比如图3-5所示，结合表2数据表明，Alto与传统SPR仪器检测的亲和力和解离速率结果基本一致，证明了Alto在SPR检测中的准确性。

与传统SPR仪器相比，Alto只需30min的手动操作时间，2uL的样品用量即可自动化完成所有实验过程，提供同等的高质量检测数据，因此Alto更适用于双特异性Imm TAC分子开发过程中的SPR表征过程，大大加快了双抗的研发进程。