原文标题：NATURE REVIEWS DRUG DISCOVERY：The emerging role of mass spectrometry-based proteomics in drug discovery

期刊：NATURE REVIEWS DRUG DISCOVERY

影响因子：112.2871

分类：蛋白组学;制药

发表日期：2022.03.29

研究机构：德国马丁斯里德，马克斯·普朗克生物化学研究所系统免疫学实验室;德国波恩大学医学院先天免疫研究所系统免疫学和蛋白质组学等。

蛋白质是大多数药物的主要作用靶点。然而，监测蛋白质活性和功能的全系统方法在药物发现中仍未得到充分利用。现将新的生化方法与基于质谱的蛋白质组学仪器和数据分析管道的最新发展相结合，已经能够使疾病表型的剖析及其调节的生物活性分子达到前所未有的分辨率和维数。本综述描述了用于靶标鉴定和安全危害识别的蛋白质组学和化学蛋白质组学方法，讨论了早期药物发现的创新策略，对其中的蛋白质组学方法产生了独特的见解，如靶向蛋白降解和反应性片段的使用，为实验设计提供了指导。

1.基于质谱(MS)的蛋白质组学已经从对生物样品中的蛋白质进行编目发展到在多个水平上评估蛋白质特性及其功能调节。其各个方面(速度、灵敏度、精确度和稳健性)均有进展，目前，基于质谱的蛋白质组学已经达到了一个允许在几小时内对几乎完整的蛋白质组进行简化分析的水平。

2.基于质谱的蛋白质组学有助于直接分析小分子与蛋白质组的相互作用。具体而言，化学蛋白质组学使生物化学或生物物理过程能够检测化合物与蛋白质的直接相互作用。

3.可以从表型观察结果和对药物治疗反应的分子指纹间接推断潜在靶或靶途径。蛋白质组学技术现在常被用于对不同的生物分子类别进行综合评估以及正交功能筛选。

4.了解疾病的发病机制是确定药物靶点的先决条件。在药物发现过程的早期对潜在药物靶标进行深入的分子和功能分析有助于确定真正的药物靶标，所以蛋白质组学研究旨在发现和验证用于疾病干预的蛋白质或途径。

药物发现可被视为一个三要素方程，其中开发了生物活性化合物来作用于分子靶标并调节疾病表型。因此，药物的发现是从不同的实验起点开始的，例如由生物活性化合物探索的target假设或疾病模型(图1).

基于靶向策略可以通过大文库的高通量筛选(HTS)或基于片段的方法来鉴定与重组靶蛋白结合的小分子。一旦识别出目标分子，就可在细胞或体内模型系统中针对亲和力、物理和化学性质、吸收和分布以及靶参与、功效和安全性对化合物进行优化。随着对疾病病理学基础的分子机制研究的加深、DNA编码的文库筛选和高温超导技术的巨大进步，这些基于靶标的方法变得非常有吸引力，如用于在优化期间分析化合物-靶相互作用的生物物理方法。然而，在历史上，大多数一流的药物已在监测疾病模型系统中对生物活性化合物的生物学反应的筛选中发现。这种表型筛选方法是不可知的，但随后的生物活性化合物的目标识别是可取的。

图1 基于质谱的蛋白质组学在临床前药物中的应用发现过程

基于质谱(MS)的蛋白质组学已经从对生物样品中的蛋白质进行编目发展到在多个水平上评估蛋白质特性及其功能调节。通过工作流程中各个方面(速度、灵敏度、精确度和稳健性)的最新进展，基于质谱的蛋白质组学已经达到了一个允许在几小时内对几乎完整的蛋白质组进行简化分析的水平(图2)。在这些技术发展的支持下，人们已经设计出能表征蛋白质组的实验方法，而不仅仅是只能列出基因产物;现代蛋白质组学方法关注生物活性分子的参与和反应性，解决蛋白质信号网络中的时空动力学，并在蛋白质组范围内产生翻译后修饰(PTMs)的全面功能注释。对此研究人员提出了实验策略，以确定药物的靶向疗效、对不良表型可能产生的潜在非靶向效应以及靶向性和选择性。同时还描述了用于剖析蛋白质丰度、周转、亚细胞局部化、相互作用和修饰以进行靶发现和验证的方法。最后，我们讨论了基础研究的创新，这些创新对早期药物发现具有重要意义，包括靶向不可逆抑制剂和蛋白质降解、基于片段的配体发现以及其他技术挑战。

图2 主要蛋白质鉴定和定量策略

1.目标识别

一个方法库可用于鉴定生物活性化合物基于细胞的筛选和体内引发其活性的分子机制。其中，基于质谱的蛋白质组学独特地有助于直接分析小分子与蛋白质组的相互作用。具体而言，化学蛋白质组学使生物化学或生物物理过程能够检测化合物与蛋白质的直接相互作用(图1)。化学蛋白质组学方法通常依赖于通过研究生物活性化合物衍生的化学探针从细胞提取物或活细胞系统中富集药物靶标。此外，一些新兴的方法利用了化合物结合对蛋白质结构和生物物理性质的影响，例如热稳定性或对蛋白水解的抗性(图3)。

图3 通过分析蛋白质的亲和力、活性、稳定性和折叠来研究药物作用的蛋白质组学方法 

1)基于探针的目标反卷积

生物活性化合物的目标识别通常基于亲和富集，其中生物活性分子由亲和标签(如生物素)或(生物正交的)反应基团衍生，以实现固定(例如在琼脂糖珠上)。亲和富集能够分离与细胞蛋白质孵育后与功能探针相互作用的蛋白质。药物亲和富集策略的早期应用将组蛋白去乙酰化酶(HDACs)鉴定为微生物来源的环四肽曲钙蛋白35的哺乳动物靶点，鉴定FKBP12为免疫抑制剂大环内酯类药物FK506和雷帕霉素的受体，并确定了罗斯科维汀的靶点这是一种细胞周期蛋白依赖性激酶的选择性抑制剂。使用标记生物活性小分子的亲和富集和基于质谱的蛋白质组学定量方法的组合为细胞蛋白质组内药物相互作用的全面分析提供了灵敏和特异的工具。这种技术通常被称为化合物中心化学蛋白质组学。

此外，小分子探针和靶蛋白之间的相互作用可以通过光反应性基团经过光亲和标记(PAL)转化为共价键，例如二嗪环和芳族叠氮基(CCCP)。由于非共价相互作用在进一步分析所需的样品制备步骤期间趋于重新平衡，因此这些共价键使得能够在活细胞中而不是仅在细胞提取物中促进靶结合。由于产生此种探针而增加的合成工作可以通过与适当的点击化学工具相结合的模块化探针体系结构来简化。例如，二型糖尿病药物吡格列酮的放射性标记光亲和类似物(PNU-91323)用于研究噻唑烷二酮类化合物(也称为格列酮)的过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPARγ)非依赖性作用模式(MoAs)，通过结合大小排阻色谱法、光亲和标记和MS-N末端测序，发现了线粒体蛋白靶标线粒体丙酮酸载体1(MPC1)和MPC2。进一步的研究揭示了这些蛋白在葡萄糖生成中的作用以及噻唑烷二酮类药物在代谢性疾病中调节MPCs的能力。

然而，无论使用的是纯的基于亲和力的探针还是更具弹性的PAL探针，由于在实验工作流程中，蛋白质与引入化合物中用于探针生成的修饰物(如接头、反应性基团、亲和力标签等)、珠基质和其他表面的非特异性结合，因此鉴定疗效靶标并非易事。蛋白质组的高动态范围(丰度最高和最低的蛋白质之间的差异)进一步使分析偏向丰度较高的蛋白质，而低丰度的target蛋白质可能会被遗漏，从而导致假阴性。

2)无化学探针的目标解卷积

上述方法虽然强大，但都需要功能化的小分子，生成这些小分子既困难又耗时。近年来，出现了几种无需探针即可检测小分子蛋白结合的蛋白质组学方法。它们利用配体诱导的对target蛋白生物物理性质的影响，通过测量存在离液剂时热稳定性、对蛋白水解的抗性或氨基酸侧链的表面暴露的变化，将这些方法与定量质谱相结合，可实现蛋白质组范围的测量。例如，热蛋白质组分析(TPP)也称为热位移分析(CETSA)，可以通过分析整个蛋白质组中药物诱导的蛋白质热稳定性变化来破译药物的MoA。为此，将细胞样品与赋形剂或药物一起孵育，并加热至一定浓度范围以诱导聚集。

随后，在一定的温度下未折叠的蛋白质沉淀。然后使用超速离心将可溶性部分与蛋白质聚集体分离，并使用MS在上清液中记录和比较蛋白质的丰度。需要注意的是，并非所有蛋白质都容易沉淀，尤其是在与细胞结构完整性相容的温度下，因此，解折叠导致的聚集可能不完全，或者对于小的亲水性蛋白质根本不会发生。初始方案仅允许检测可溶性细胞内靶标;然而，最近的改进证明了细胞内隔室的膜蛋白和质膜的结合。

基于裂解物和基于细胞的实验的比较可以检测和区分由于蛋白质与化合物的直接相互作用引起的热稳定性变化以及由于下游效应引起的变化，例如蛋白质与不同生物分子类别或PTMs的相互作用。热位移的大小取决于化合物的浓度和亲和力，也取决于靶结构蛋白。

2.识别MoAs的间接策略

1)蛋白质丰度

蛋白质丰度的改变可能表明药物对蛋白质合成或降解的直接或间接影响。然而，每种蛋白质的丰度取决于基因转录、RNA剪接和翻译，它们调节蛋白质的产生以及蛋白酶体或溶酶体的降解和蛋白质的分泌。尽管转录水平常被用作蛋白质丰度的替代，但对mRNA相对于蛋白质水平的系统评估显示，仅存在部分和条件相关的相关性，因此蛋白质组水平上的定量更为准确。

全局蛋白质组分析检测对药物治疗有反应的蛋白质丰度(图4)。蛋白质组随时间的变化可以反映所需的化合物效应，但也可能反映恢复体内平衡的不利或副作用或补偿机制，从而导致耐药性。例如，用常山酮处理的心脏成纤维细胞的蛋白质组学分析揭示了可归因于脯氨酰-tRNA合酶抑制的广泛蛋白质组变化。此外，分析治疗抗性细胞可能揭示这种抗性的潜在机制。例如，曲妥单抗耐药胃癌细胞中WNT–β-catenin通路的激活表明该通路可能是一个潜在的抗耐药靶点。跨药物和细胞系的分析从机理上提出了一种将化合物作用与全局蛋白质组扰动联系起来的策略。响应于细胞表面受体连接和内化的蛋白质降解也可通过表达蛋白质组学容易地检测到，如图所示，如表皮生长因子受体(EGFR)，可作为多种癌症药物的靶点。该方法进一步鉴定了免疫调节药物来那度胺对酪蛋白激酶1α(CK1α)以及ikaros和aiolos转录因子的降解，其启发了药理学策略，例如基于将新底物胶粘至降解的蛋白水解靶向嵌合体(PROTACs)、分子方式的泛素连接酶复合物。为了确定药物治疗是否影响全球蛋白质周转，可在动态pulse-chase实验中使用细胞培养物中氨基酸的稳定同位素标记对所有新合成的蛋白质进行代谢标记(SILAC)，这使得它们可与细胞中已经存在的蛋白质区分。

图4 蛋白质组学通过分析蛋白质丰度、定位、相互作用和修饰来研究药物作用机制以及疾病生物学的策略

2)蛋白质定位

蛋白质组学同样能够提供蛋白质丰度以外的信息，如蛋白质在细胞或组织中的定位。基于亚细胞组分的选择性富集或耗竭，专业方法能够对亚细胞区室或结构进行集中观察。当药物的推定MoA指导此类研究时，这些方法能够对细胞器中的蛋白质进行全面分析，如细胞核或线粒体也在细胞表面或细胞外空间。为了绘制跨多个亚细胞区室的空间蛋白质动力学图，对分级细胞器和基于邻近连接的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络的蛋白质组学分析也同样成为了强有力的工具(图4d)。机械裂解的细胞可以通过梯度离心进行生物化学分级，然后对每个级分进行质谱分析。这些“蛋白质相关性分析”方法的现代变体通过蛋白质在组分中的定量分布将蛋白质分配给亚细胞区室，克服了难以实现的纯化细胞器的要求。

这些方法追踪了活化的EGFR从细胞表面向内溶酶体的易位，伴随着衔接蛋白前体生长因子受体结合蛋白2(GRB2)和SHC1从胞质溶胶向内溶酶体的募集。值得注意的是，尽管总丰度没有改变，但细胞内蛋白质的再定位很容易被检测到。尽管所描述的来自梯度离心的蛋白质相关性概况提供了多细胞器图的基础，基于相关性的方法在数据采集时间方面要求较高，且尚未被验证用于探索小分子药物作用，但提高空间分辨率和处理量将使其对MoA的无假设研究具有吸引力。

3)蛋白质相互作用

PPIs的经典方法通过免疫沉淀或亲和纯化捕获直接和间接的蛋白质相互作用物单一内源性或表位标记的蛋白质相互作用因子(图4d)。无论药物是否存在，都可以对蛋白质复合物的成员进行分析，从而可以检测对化合物敏感的PPI，并探索化合物调节靶活性的机制。这与设计用于抑制特定PPI的分子相关，也提供了针对多蛋白复合物催化亚基的小分子的机理和复合物选择性的信息。区分特异性与非特异性PPI对于解释相互作用蛋白质组学实验至关重要。用于该目的的分析策略包括用一种以上针对靶的抗体、同种型匹配的阴性对照进行富集，以及对共富集的污染物进行实验和计算机描绘。仅在短时间内发生的物理相互作用，如酶和底物(如E3泛素连接酶及其功能性E2配偶体)之间的相互作用，仍然难以用标准相互作用蛋白质组学来捕获。定制的交联和生物化学策略提供了一个起点来剖析弱的与直接和间接的粘合剂以及蛋白质相互作用的3D结构信息。

4)蛋白质的翻译后修饰

大多数细胞内信号转导通路受PTMs对蛋白质的动态修饰调控。全面检测稳定的PTM修饰肽的蛋白质组学方法已得到很好的建立，可用于监测药物诱导的信号传导变化(图4c)。由于大多数动态PTM是亚化学计量的(它们仅出现在蛋白质的一个子集上)，这些工作流程通常包括使用具有适当物理性质(如正电荷状态或疏水性，用于磷肽富集)或抗体的基质的富集步骤。因此，它们可能比表达蛋白质组学实验需要更多的生物起始材料。

全局磷酸化蛋白质组学常用于检测RTKs下游的信号通路激活或抑制和GPCRs。因此，它可以通过鉴定活化或药物抑制激酶的底物来补充化学蛋白质组学方法。癌症中的耐药性通常与RTK下游信号的代偿性重新布线有关。在本文中，磷酸化蛋白质组学可以定义对单一药物治疗的适应性激酶反应或评价药物治疗组合。显著的发现包括对拉帕替尼耐药患者的Src家族激酶的干扰乳腺癌细胞，以及曲妥单抗耐药乳腺癌细胞中的Src激酶和MAPKs。

通过研究较少或分析难度较大的PTM(如酸不稳定和热敏性蛋白质-组氨酸磷酸化)进行的基于质谱的信号分析，可能在未来揭示新的药理学上可处理的细胞信号检查点。PTM工作流程通过使用与胰蛋白酶具有不同特异性的蛋白酶或亲和富集蛋白质信号复合物增加蛋白质序列的覆盖范围，从而使额外的PTM修饰的肽易于获得。

3.目标发现和验证

了解疾病的发病机制是确定药物靶点的先决条件。因此，在药物发现过程的早期对潜在药物靶标进行深入的分子和功能分析有助于确定真正的药物靶标。人体活检样本(包括大量福尔马林固定、石蜡包埋的组织样本)、储存在生物库中以及动物、器官样或原代细胞培养疾病模型作为生理学相关揭示病理学中失调蛋白或信号级联的起点。在此，我们强调蛋白质组学研究，旨在发现和验证用于疾病干预的蛋白质或途径。在许多实例中，蛋白质组学鉴定了早期肝细胞癌中的活化信号通路，如肿瘤抑制物视网膜母细胞瘤RB1的过度磷酸化(REF)，其随后在功能上被证实为结肠癌中的驱动因子和治疗靶标。

此外，CDK7升高(REF)NNMT的磷酸化和基质表达在卵巢癌中被检测到，并且phar-macology抑制两种被抑制的癌细胞增殖。值得注意的是，就深入了解疾病的分子机制而言，基于质谱的方法优于平行基因组和转录组分析。例如，在髓母细胞瘤中，MYC磷酸化与不良结局相关，或在乳腺癌中，高度磷酸化的GPCR簇和PAK1、PTK2、RIPK2以及丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶缠结样2(TLK2)被鉴定为潜在靶标。

4. 药物安全性和有效性

非临床毒理学或临床安全性导致的化合物损耗是制药行业面临的一个重要挑战。在早期药物发现阶段研究候选药物的次要药理学可最大程度地减少开发阶段的药物不良反应(ADR)和后期的磨损。最近的一项分析报告称，60%的失效化合物是由于临床前毒性而终止的，其中40%是由于I期和II期临床试验中的安全性考虑而终止的。第一代蛋白激酶抑制剂具有相关的心脏毒性，许多药物具有广泛的GPCR活性。值得注意的是，HDAC抑制剂常常是混杂的，缺乏靶选择性会增加毒性风险，限制其临床应用。药物多药疗法不一定是负面的，因为药物作用于多个目标可以更有效。例如，在癌症治疗中发现未知的偏离靶位可为药物重新确定用途提供机会。伊马替尼(慢性髓性白血病中BCR-ABL融合蛋白的酪氨酸激酶抑制剂)对RTK KIT的功能增益突变体具有意外的脱靶活性，这对于胃肠道间质瘤的发生至关重要。药物超敏反应和药物诱导的特异性自身免疫表明，一些小分子部分具有调节免疫系统自身耐受的能力，并通过HLA或先天免疫受体识别异常激活免疫应答。基于质谱的研究在确定此类药物相关毒性的分子决定因素方面将越来越有价值。

尽管本综述中描述了许多进展和成功，但由于成本和所需专业知识，蛋白质组学分析对药物发现的影响仍然受限于获得质谱技术的途径。研究人员认为这种情况正在发生变化，因为基于质谱的蛋白质组学越来越被认为是阐明疾病失调机制和监测药物作用的有力和通用工具。可用的仪器、软件和工作流程已经基本成熟，并且变得更加强大。尽管与RNA测序方法等其他组学技术相比，蛋白组学仍然缺乏敏感性和覆盖范围，但它提供了与疾病和药物作用的机制信息直接相关的独特功能维度。基于质谱技术的预期进一步发展将进一步增加灵敏度和处理量，并且将能够研究仅仅几个或单个细胞、细胞异质性、药物作用的亚细胞空间机制和分子缺陷表型。这些发展受到新兴计算概念和软件的支持，正在日益改变光谱解释，并将使尚未识别的PTM、反应性探针或药物加合物变得触手可及。

化学蛋白质组学和具有时空分辨率的深层蛋白质组分析方面的最新技术进展，通过促进靶标验证和模型表征，为早期药物发现提供了支持。可以使用“深度视觉蛋白质组学”对活检样本中的单细胞类型或状态进行深入分析，该技术结合了人工智能驱动的细胞分割和分类，然后是超高灵敏度蛋白质组学。当在药物治疗前后进行时，这种新的精确肿瘤学方法可以在空间背景下直接可视化肿瘤适应和逃逸。这些进展可以建立从体外到体内系统的可转性，为模式选择提供信息，并支持导联优化、药物MoA研究和安全性研究。对于靶识别，基于蛋白质组学的策略是有希望的，但是还没有提供“一站式”的方法，因为每种方法都有它的优点和局限性。尽管存在所讨论的挑战，但越来越多的成功案例证明了直接和间接方法如何能够识别疾病和药物机制，提供靶点证据，甚至提出药物再利用的机会。靶标分析方法可在基于细胞的筛选中识别生物活性分子的分子靶标，而在先导优化过程中对靶标选择性的表征可实现结构导向设计。同样，引发不良结局途径的偏离目标活动所导致的安全危害也可及早发现。将此类方法系统地嵌入到药物发现项目中，将极大地缩短从命中到引导到候选的周期，并可能减少后期损耗。

1. Meissner F, Geddes-McAlister J, Mann M, Bantscheff M. The emerging role of mass spectrometry-based proteomics in drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 2022 Sep;21(9):637-654. doi: 10.1038/s41573-022-00409-3. Epub 2022 Mar 29. PMID: 35351998.

2. Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B. & Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br. J. Pharmacol.162, 1239–1249 (2011).

3. Clark, M. A. et al. Design, synthesis and selection of DNA-encoded small-molecule libraries. Nat. Chem. Biol. 5, 647–654 (2009).

4. Renaud, J. P. et al. Biophysics in drug discovery: impact, challenges and opportunities. Nat. Rev. Drug Discov. 15, 679–698 (2016).