Title:High-throughput quantitative proteomics using Zeno SWATH data-independent analysis (DIA) and the Evosep One system

题目：使用Zeno SWATH数据独立分析(DIA)和Evosep One系统的高通量定量蛋白质组学

Journal: Sciex Application note

Abstract:

Identifying and quantifying large numbers of proteins and peptides are important in translational research to understand biological functions. One example of this is the analysis of large sample cohorts to identify robust biomarkers of disease. The complexity of biological fluids, tissues and cell lines often overwhelms the capabilities of data-dependent acquisition (DDA) strategies using mass spectrometry due to the stochastic nature of this methodology. This limitation has driven the rapid adoption of data-independent acquisition (DIA or SWATH DIA) approaches, such as Zeno SWATH DIA. This method achieves5-6x more MS/MS sensitivity,resulting in this DIA approach surpassing DDA for protein identifications and quantification in complex matrices. This advantage is further observed at short acquisition times that are required to meet the throughput demands of current proteomics studies.

Evosep One系统与ZenoTOF 7600系统的主要特性

• 使用ZenoTOF 7600系统的Zeno SWATH DIA大大提高了肽段MS/MS的灵敏度，一次运行可多定量50%的蛋白质

• Evosep One系统是一个强大的标准化平台，专为高通量研究而设计，具有特定的工作流程模式，适合任何定量蛋白质组学研究

• ZenoTOF 7600系统上MS/MS采集的高速度和高灵敏度使其能够轻松与Evosep One系统工作流程相结合

• 30 SPD方法和上样量200 ng的情况下，CV<20%的约6200种蛋白质 (图1)

• DIA-NN软件的数据处理针对快速色谱进行了优化，可以提供许多肽和蛋白质的定量信息

1. 样品制备

用95%缓冲液A(含0.1%甲酸的水)和5%缓冲液B(含0.1%甲酸的乙腈)将商品化的人细胞系胰蛋白酶消化物(HeLa，Thermo Fisher Scientific)溶解到合适浓度0.1 µg/µL。25 ng上样量对应的浓度 1.25 ng/ µL，50 ng上样量对应的浓度是2.5 ng/ µL，200 ng上样量对应的浓度是10 ng/ µL，500 ng上样量对应的浓度是25 ng/ µL。将不同浓度的20 µL样品加载到Evotips中。

2. 色谱方法

Evosep One系统(Evosep，丹麦)使用预设的SPD方法配置进行操作，如表1中所述。流速和色谱柱对应相应的规格。图2显示了50 ng上样量的色谱图。Evosep One系统的控制与SCIEX OS软件完全集成，因此一个批次可用于控制LC和MS。

表1. 4种不同方法的色谱条件，不同的运行时间对应不同的色谱柱和不同的流速

图2 . 不同Evosep工作流程的总离子色谱图(TIC)。对于不同的SPD工作流程，总运行时间不同，50 ng上样量的TIC所示

3. 质谱方法

ZenoTOF 7600系统使用OptiFlow Turbo V离子源以Zeno SWATH DIA模式运行。200 SPD、100 SPD和60 SPD通量方法在微流下运行，30 SPD方法在纳流下运行，如表2所述。对每个测试条件进行三次分析。

表2. 4种不同SPD实验的质谱设置。随着不同色谱方法的流速变化，质谱条件也进行了调整，以确保获得良好的循环时间。所有实验的气帘气体为25 psi

4. 数据处理

使用DIA-NN软件beta版本1.8.1.3处理Zeno SWATH DIA数据。

1. 蛋白质定量

在ZenoTOF 7600系统上使用Zeno SWATH DIA，将消化的HeLa细胞裂解物用于不同SPD工作流程。在这些实验中，使用了200和50 ng的样品量(分别见图1和图3)。用户选择最符合其实验需求的通量和蛋白质组覆盖深度的工作流程和所需样品量。

对于两种上样量，随着SPD的减少和样品分析时间的增加，鉴定和定量的蛋白质数量增加(图3)。当通量从200 SPD减少到30 SPD时，在50和200 ng上样量下，在小于1% FDR下分别多鉴定了102%和82%的蛋白质。更重要的是，在CV < 20%时定量的蛋白质数量也大大增加，在50和200 ng上样量时分别增加了77%和80%。

对于50 ng的HeLa消化物(图3)，30 SPD的工作流程提供了最大的蛋白质组覆盖率。使用Zeno SWATH DIA，检测到5727个蛋白质组，其中4232个蛋白质组的定量CV < 20%(图3)。在这种加载和SPD工作流程下，74%的检测蛋白质得到了可靠的定量。

图3. 比较了在不同SPD下从Zeno SWATH DIA数据中在< 1% FDR(透明)下鉴定和在< 20% CV(深色)下定量的蛋白质数量。更长的运行时间和更高的上样量(图1和3)为更深的蛋白质组覆盖范围提供了更多的定量蛋白质

2. Zeno SWATH DIA数据的无库蛋白质鉴定

一个由软件算法改进推动的新兴工作流程用来处理DIA数据的无库方法。这里，使用DIA-NN软件将FASTA文件转换成光谱库，用于数据处理。来自这些实验的Zeno SWATH DIA数据使用计算机库和从实验ZenoTOF 7600系统数据生成的光谱库进行处理。这些结果还与使用Pan Human库处理数据生成的结果进行了比较(图4上)。

图4 200 ng上样量下比较是否建库的蛋白定量结果

使用计算机生成的数据库的分析表现出来与使用2个实验生成的数据库的分析相似的蛋白质鉴定结果(图4)。在30 SPD时，使用未建库方法在< 1% FDR鉴定了6417种蛋白质，而使用ZenoTOF 7600文库鉴定了7014种蛋白质。

3. 肽前体定量

最后，检测了SPD和上样量对定量肽前体数量的影响(图5)。上样量200 ng，在200 SPD下定量了约15000种前体，30 SPD时约为42000(图5)。当通量从100SPD减少到60SPD时，出现了最显著的提升，定量增加了43%。

图5 在不同的SPD条件下对肽前体进行定量

就SPD通量和不同的上样量而言，60 SPD的通量提供了检测和定量性能之间的平衡。正如预期的那样，较低的SPD通量和较高的上样量使蛋白质检测和定量的增加。此处提供的蛋白质和肽数据可用于指导选择合适的样品上样量和所需的通量，以满足未来的研究需求。

在该研究中，使用Zeno SWATH DIA的ZenoTOF 7600系统提供了出色的蛋白质组覆盖深度和高定量重现性，这是因为启用了Zeno trap后MS/MS灵敏度提高了。在这里，Zeno SWATH DIA与Evosep One系统相结合，展示了与该系统的兼容性，并突出了高通量定量蛋白质组学应用的各种工作流程。

• 通过在30、60、100和200 SPD测试HeLa消化物的2种上样量(50和200 ng)来改变样品负载和通量

• 随着运行时间的增加和样品通量的减少，蛋白质组覆盖的深度增加

• 当以30 SPD加载200 ng样品时，在小于1% FDR下检测到约7000种蛋白质，其中约6200种蛋白质的定量变异系数小于20%

• 分析Zeno SWATH DIA数据，这些数据是在Evosep One系统上分离后收集的，使用无库工作流产生了与典型的基于库的方法相当的结果。

1. Large-scale, targeted, peptide quantification of 804 peptides with high reproducibility, using Zeno MS/MS. SCIEX technical note, RUO-MKT-02-13346-A.

2. Going library-free for protein identification using Zeno SWATH DIA and in silico-generated spectral libraries. SCIEX technical note, RUO-MKT-02-14675-A.

3. Zeno MS/MS with microflow chromatography powers the Zeno SWATH DIA workflow for more proteins quantified. SCIEX technical note, RUO-MKT-02-14668-A.

4. Processing ZenoTOF 7600 system data with DIA-NN software. SCIEX community post, RUO-MKT-18-14611-A.

5. Demichev V et al. (2019) DIA-NN: neural networks and interference correction enable deep proteome coverage in high throughput. Nature Methods, 17, 41-44.