原标题：Correlation between biological responses in vitro and in vivo to Ca-doped sol-gel coatings assessed using proteomic analysis

发表期刊：Colloids and Surfaces B: Biointerfaces

发表日期：Available online 21 October 2022

研究领域：蛋白质组学

技术平台：液相质谱(Waters nanoACQUITY UPLC、Thermo Orbitrap XL spectrometer、Evosep One、Bruker timsTOF Pro with PASEF)

样本：人血清、兔骨蛋白

体外测试结果与随后的体内实验之间的相关性差阻碍了生物材料的设计。因此，需要新的表征方法。本研究使用蛋白质组学和组织学技术分析了钙掺杂生物材料在体外和体内的作用，并验证了两种系统之间的相关性。采用溶胶-凝胶法合成了含0.5和5% CaCl2功能化的涂层;通过ICP-AES光谱分析材料中Ca2+离子的释放。体外检测人成骨细胞(HOb)和TPH-1单核细胞的成骨和炎症反应。体内实验使用兔子模型。基于nLC MS/MS的蛋白质组学方法用于分析粘附在与人血清孵育的材料样品上的蛋白质，或检查植入物附近组织中的蛋白质表达。钙掺杂的生物材料在体外(PLMN、THRB、FIBA和VTNC)和体内(FBLN1、G1U978)引起凝血相关蛋白的吸附显著增加。还观察到与炎症相关的蛋白质(体外CO5、C4BPA、IGHM和KV302;体内CARD6、DDOST和CD14)和成骨功能(体外TETN、PEDF;体内FBN1、AHSG和MYOC)对这些材料的亲和力增强。使用不同技术获得的结果非常匹配，体外和体内实验之间具有良好的相关性。因此，体外生物材料生物反应的蛋白质组学分析是预测其体内影响的有用工具。

对于体外样品的蛋白质组学分析使用Nano ACQUITY UPLC和Orbitrap XL光谱仪。使用Progensis QI软件对研究表面上鉴定的蛋白质进行差异分析。体内样品在与EvoSep ONE液相色谱仪在线耦合的混合捕获离子迁移率-四极飞行时间质谱仪中进行分析。将消化的骨蛋白(200ng)直接加载到EvoSep ONE色谱仪上，并使用30 SPD方法。

结果1：蛋白质组学分析-体外实验

用LC-MS/MS技术对吸附在溶胶-凝胶涂层上的蛋白质洗脱液进行分析，鉴定出107种不同的蛋白质。使用Progensis QI软件对附着在钙涂层上的蛋白质和结合在参考溶胶凝胶材料(MT)上的蛋白质的相对数量进行统计比较。David和Panther数据库以及UniProt工具被用来根据它们的功能对这些蛋白质进行分类。比较分析(Progensis QI)的结果如表1所示。与参考样品相比，19种蛋白质在钙掺杂的溶胶-凝胶上的吸附水平增加。

表1与基材相比，富钙涂层上差异吸附蛋白质的成因分析。

19种与含钙物质亲和力增强的蛋白质中，有一些与免疫体系统有功能联系。分析发现了与补体系统激活(CO5)及其抑制相关的蛋白质(CLUS、C4BPA、CFAH、IC1和VTNC)以及免疫球蛋白IGHM和KV302。其他一些优先与钙掺杂材料结合的蛋白质(HRG、FIBA、THRB、PROS、PLF4和PLMN)与凝血和纤溶过程有关。同样，我们观察到与新骨发育有关的蛋白质(如PEDF)的吸附增加。TETN的结合增强，参与种植体整合过程，如细胞黏附、细胞外基质和骨矿化，也被检测到。

图1说明了与植入触发的过程有关的蛋白质的归一化丰度随钙剂量的变化。因此，与炎症(蓝色)、凝血(红色)、纤溶(黑色)和骨再生(绿色)相关的蛋白质被显示出来。

图1.在再生过程中具有关键功能的12种不同吸附蛋白的正常化丰度。

PANTHER程序根据蛋白质与信号通路及其生物过程的联系对蛋白质进行分类。图2显示，凝血是与不同吸附到掺杂有CaCl2的材料(尤其是MT5Ca)上的蛋白质相关的主要途径。还检测到与其他途径的关联，其比例不同，这取决于涂层中掺入的钙的百分比。因此，与补体系统相关的B细胞的激活出现在含0.5%Ca的涂层中。CCKR信号传导对血管生成有影响，与含5%Ca的材料上发现的蛋白质有关。与纤溶酶原级联激活相关的功能也被鉴定为对Ca表面亲和力增强的蛋白质，其影响纤溶。在检测到的各种生物学功能中，免疫系统、细胞过程、代谢过程、对刺激的反应、生物粘附和定位与钙材料上不同吸附的蛋白质有关。对于MT0.5Ca，与生物发生、多细胞生物过程和生物调节功能相关的蛋白质也出现了。

图2.与参考样品(MT)相比，PANTHER图显示了与蛋白质相关联的途径功能和生物学过程，与富钙溶胶-凝胶涂层的粘附性增加。

结果2：蛋白质组学分析-体内实验

用nLC-MS/MS分析了未掺杂和掺钙涂层种植体周围组织的蛋白质组，鉴定了2258种不同的蛋白质。Progensis QI分析表明，与MT0.5Ca和MT5Ca种植体接触的组织中，与MT接触的组织中76种蛋白质的水平不同(表S2)。其中，33个在钙掺杂种植体表面周围组织中的含量低于参考样本(MT)。在与富钙涂层接触的组织中，其余43种蛋白质的水平有升高的趋势。

图3显示了与炎症过程(CARD6、CD14、SERPING1和DDOST;蓝色)、凝血(FBLN1和G1U978;红色)和骨再生(FBN1、AHSG和MYOC;绿色)相关的主要蛋白质的归一化丰度随钙含量的变化。

图3：体内差异表达的9种蛋白质的正常丰度，在再生中具有关键功能;。

结果3：体内实验-组织学

如图4A-C所示，在靠近钛种植体的髓腔内有一些骨颗粒和碎屑。这些受损的骨组织颗粒含有空骨细胞陷窝。种植体槽内衬有溶胶-凝胶涂层。在种植体的凹槽和顶部附近有一层稀薄而模糊的基质。这些可能是手术后形成的种植体周围初始血凝块中富含纤维蛋白的基质的残留物。在MT和MT0.5Ca植入物(分别图4A1和图B1)中，在这个基质中观察到一些来自初始血凝块的稀疏红细胞团。与其他类型的种植体相比，MT5Ca上的红细胞团更大更常见(图4c1)。植入物之间的另一个区别是在植入物表面附近发现的具有成纤维细胞形态的间充质细胞的数量。在MT种植体附近观察到很少的成纤维细胞样细胞(图4A2)，而在MT0.5Ca和MT5Ca钙掺杂种植体的顶端部分有大量的成纤维细胞样细胞(图4B2和C2)。

图4：手术后5天处理的对照和掺钙种植体样本的显微照片。

这种新型的钙掺杂溶胶凝胶材料能够释放钙离子，通过体外和体内实验进行了表征，为体内蛋白质组学分析提供了有价值的数据。钙掺杂影响成骨细胞和TPH-1单核细胞的体外反应，以及蛋白质在涂层上的吸附。肿瘤坏死因子-α、IL-1b、转化生长因子-β和IL-10水平的变化表明，炎症反应依赖于材料中钙的含量。此外，体外和体内蛋白质组学显示，与免疫、凝血和再生过程相关的一组蛋白质的粘附性增加。在涂层中添加钙离子，在体外增加了对VTNC、CO5、C4BPA和KV302等参与免疫应答的蛋白质的吸附，在体内增加了CARD6、DDOST和CD14的水平。对凝血活性的影响与此类似，如体外FIBA、THRB或PLMN的丰度，体内FBLN1和G1U978的丰度。此外，TETN或PEDF(体外)和FBN1、AHSG或MYOC(体内)等蛋白质水平的变化表明MT0.5Ca制剂最有可能具有良好的成骨性能。蛋白质组学结果与组织学观察到的生物学反应一致。蛋白质组学分析表明，体外实验和体内实验(短实验周期)具有很好的相关性。因此，我们可以得出结论，这些方法在开发新的生物材料方面是有用的。

García-Arnáez I, Romero-Gavilán F, Cerqueira A, et al. Correlation between biological responses in vitro and in vivo to Ca-doped sol-gel coatings assessed using proteomic analysis[J]. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2022: 112962.https://doi.org/10.1016/j.colsurfb.2022.112962