原标题：Mouse Paneth Cell-Enriched Proteome Enabled by Laser Capture Microdissection

发表期刊：Journal of Proteome Research

发表时间：2022.09.25

研究领域：蛋白质组学

技术平台：液相质谱(Evosep One LC、Thermo Orbitrap Exploris 240 MS)

样本：小鼠肠道组织

Abstract:

Paneth cells are antimicrobial peptide-secreting cells located at the base of the crypts of the small intestine. The proteome of Paneth cells is not well defined because of their coexistence with stem cells, making it difficult to culture Paneth cells alone in vitro. Using a simplified toluidine blue O method for staining mouse intestinal tissue, laser capture microdissection (LCM) to isolate cells from the crypt region, and surfactant-assisted one-pot protein digestion, we identified more than 1300 proteins from crypts equivalent to 18,000 cells. Compared with the proteomes of villi and smooth muscle regions, the crypt proteome is highly enriched in defensins, lysozymes, and other antimicrobial peptides that are characteristic of Paneth cells. The sensitivity of the LCM-based proteomics approach was also assessed using a smaller number of cell equivalent tissues: a comparable proteomic coverage can be achieved with 3600 cells. This work is the first proteomics study of intestinal tissue enriched with Paneth cells. The simplified workflow enables profiling of Paneth cellassociated pathological changes at the proteome level directly from frozen intestinal tissue. It may also be useful for proteomics studies of other spatially resolved cell types from other tissues.

Paneth细胞是位于小肠隐窝底部的抗菌肽分泌细胞。由于Paneth细胞与干细胞共存，其蛋白质组并不明确，因此难以单独在体外培养Paneth细胞。使用简化的甲苯胺蓝O法染色小鼠肠道组织，激光捕获显微切割(LCM)分离隐窝区域的细胞，以及表面活性物质辅助的一锅蛋白质消化，我们从隐窝中鉴定了1300多种蛋白质，相当于18,000个细胞。与绒毛和平滑肌区的蛋白质组相比，隐窝蛋白质组含有高度丰富的防御素、溶菌酶和其他Paneth细胞特有的抗菌肽。基于LCM的蛋白质组学方法的灵敏性用较少的细胞等效组织进行了评估：3600个细胞可以达到类似的蛋白质组覆盖。这项工作是首次对富含Paneth细胞的肠道组织进行蛋白质组学研究。简化的工作流程可以直接从冷冻的肠道组织在蛋白质组水平上分析Paneth细胞相关的病理变化。它也可能对来自其他组织的其他空间分辨细胞类型的蛋白质组学研究有用。

图文摘要

Evosep One LC：在15 cm×150 μm柱(Evosep，CAT#EV-1106，填充1.9 μm C18珠子)上分离EvoTips上的多肽。流动相为0.1% FA为A溶剂，0.1% FA在乙腈溶液中为B溶剂，洗脱剂B含量小于35%，流速为0.5 μL/min。每次运行的总分离时间为44 min(每天30个样品或SPD方法)。

Thermo Orbitrap Exploris 240 MS：将来自LC的流出物耦合到不锈钢发射器(Evosep，CAT#EV1086)，以正电离模式电喷雾。全MS AGC目标3×106，MS/MS AGC目标1×105，动态排除25 s，质量隔离窗口1.6 m/z，最小强度阈值1×105，以及归一化HCD碰撞能量30。

结果1：蛋白质组回收的消化方法评价

从LCM过程中收集的少量组织对蛋白质组学分析构成了挑战。具有高效和高回收率的蛋白质消化方法可以极大地方便下游的LC-MS分析。为此，将TBO染色的肠道组织(0.03 mm3，约15,000个细胞)切成薄片，以模仿从LCM收集的样本(图1A)。对加入不同表面活性剂或洗涤剂(0.1% DDM、5% SDS和1% PPS)的三种消化方法在多肽回收和多肽鉴定方面的效率进行了评估。我们重复分析的结果表明，DDM方法比SDS和PPS方法的多肽回收率高出220%以上(图1B)。同样，DDM方法在多肽和蛋白质鉴定方面也表现出色，蛋白质组覆盖率增加到>178%(图1C)。因此，我们选择了DDM方法进行后续的LC-MS蛋白质组学分析。

图1：不同消化方法的性能评估

结果2：LCM小鼠肠道蛋白质组学

肠横切面的不同区域含有不同类型的细胞。从肠腔向外，绒毛主要由肠细胞、树突状细胞和杯状细胞组成;隐窝的Paneth细胞和干细胞;肌层的平滑肌细胞和肠神经系统。我们应用激光共聚焦显微镜收集对应于这三个不同区域的样本，相当于每个样本的约18,000个细胞，并使用DDM消化法进行蛋白质组学分析 (图2A)。在所有分析的样本中，共鉴定出1532个蛋白质组，错误率低于1%，其中89.3%已被共同鉴定(图2B和补充表1)。对存在于所有三个重复中的至少一个组的1453个蛋白质组进行了进一步的定量分析，隐窝样本与平滑肌样本的相关性低于绒毛样本。同样，等级聚类分析表明，隐窝和绒毛样本比平滑肌肉样本更接近。主成分分析表明，这三组样本可以用68.8%的方差来区分(图2D)。同样，肌肉样本在主成分1上与隐窝和绒毛样本明显不同。这些结果表明，我们简化的基于LCM的蛋白质组学方法可以在小鼠肠道组织中发现细胞群丰富的蛋白质组模式，具有很高的重复性。

图2：基于LCM的小鼠肠道蛋白质组的空间图谱。

我们能够从小鼠肠道隐窝区的3600个细胞中鉴定出1300个蛋白质。这是通过多方面的改进实现的：

(1)简化的TBO组织染色方案，易于可视化和组织完整性;

(2)一锅蛋白质消化方法，由DDM表面活性剂辅助，以最大限度地减少样品损失。我们推断大多数富含隐窝的蛋白质来源于Paneth细胞。

据我们所知，这是首次报道从肠组织中富集小鼠Paneth细胞蛋白质组。这项工作中开发的方法将能够直接从冷冻肠组织中研究Paneth细胞病理学。

Woo J, Schoenfeld M, Sun X, et al. Mouse Paneth Cell-Enriched Proteome Enabled by Laser Capture Microdissection[J]. Journal of Proteome Research, 2022.https://doi.org/10.1021/acs.jproteome.2c00311