原标题：Profiling the Plasma Apolipoproteome of Normo- and Hyperlipidemic Mice by Targeted Mass Spectrometry

发表期刊：Journal of Proteome Research

发表日期：2022.06.14

研究领域：血浆蛋白质组

技术平台：液相质谱(Evosep One、Thermo TSQ MS)

样本：小鼠的血浆及动脉组织

动脉粥样硬化性心血管疾病是全球主要的死亡原因。几十年来，动脉粥样硬化的小鼠模型一直是遗传学和药物干预的临床前测试的主要手段。动脉粥样硬化的小鼠模型依赖于脂蛋白颗粒携带的循环胆固醇的超生理水平。脂蛋白颗粒具有不同的致动脉粥样硬化作用，在小鼠的临床前干预过程中监测脂蛋白水平至关重要。不幸的是，通常在临床前实验期间收集的小血浆体积限制了对总胆固醇和甘油三酯水平的分析。在这里，我们建立了一种高通量、低成本的靶向多反应监测(MRM)稳定同位素稀释(SID)质谱分析方法，使用几微升小鼠血浆相对定量九种载脂蛋白。我们应用MRM方法对两种动脉粥样硬化模型的血浆载脂蛋白组进行了研究：广泛使用的ApoE基因敲除模型和新兴的重组腺相关病毒介导的肝脏PCSK9过表达模型。通过应用大小排斥层析分离血浆池的方法，我们提供了在这些模型中载脂蛋白跨脂蛋白种类的分布的深入特征，最后，我们使用该方法来定量载脂蛋白在小鼠动脉粥样硬化斑块中的沉积。综上所述，我们报告了一种MRM分析的开发和应用，该方法可以被其他研究人员采用来在临床前研究中监测小鼠血浆载脂蛋白组。

LC-MS：所有的测定肽与0.5 μg蛋白相对应的混合物装载到EvoTip上。样品使用集成的Microflow Evosep One高效液相色谱/TSQ Altis三重四极杆质谱仪系统进行分析，该系统配备了易于喷雾的离子源(Evosep BiosSystems和Thermo Fisher Science)。Evosep One安装了一个8 cm的分析柱，样品在预定的SRM模式下使用每天60个样品的LC方法进行分析。

结果1：高通量靶向质谱法测定小鼠血浆载脂蛋白

我们建立了一种高通量的MRM-MS方法，可以同时定量小鼠血浆中的ApoA-I、ApoA-II、ApoA-IV、ApoB48/100(总ApoB)、ApoB-100、ApoC-I、ApoC-III、ApoD、ApoE和apom。通过蛋白质组标志肽与相应的稳定同位素标记标准多肽(SIS)的比值，对所有被测蛋白质进行半定量。所有20个受监测的多肽、它们各自的质量转变和分析精密度特征如表1所示，它们在初级载脂蛋白序列中的位置如图1a所示。

我们的目标是每个蛋白质至少包含两个肽;然而，对于ApoA-II、ApoC-I、ApoC-III和apom，只有一个肽符合纳入标准。尽管单肽分析可能不那么可靠，但在本研究期间分析的任何样本中，这些载脂蛋白多肽的检测和定量都没有受到影响。

表1：实验性能

我们使用优化的96孔板TFE程序(图1b)，获得了高度可重复的测定，测定内CV为3.2-11.6%(平均6.3%)，测定间CV为3.7-13.4%(平均8.3%)。通过对每个SIS肽进行标准曲线(图S1)进一步验证了检测范围和线性。所有定量的血浆蛋白都在线性检测范围内，因此可以确定由于小鼠模型的不同基因型而引起的显著浓度变化。此外，来自同一脂蛋白的检测肽显示了彼此之间的相关性以及与相应的计算脂蛋白水平的相关性(图S2)，并且来自同一脂蛋白的检测肽具有相同的SEC-洗脱图谱(图S3)。我们进一步评估了血浆中的脂蛋白在4℃下储存8、24和72 h以及重复冻融循环后的稳定性。虽然样品在多次冻融循环后是稳定的，但血浆在4℃储存72小时后，往往会导致载脂蛋白A-II、载脂蛋白B、载脂蛋白C-I和载脂蛋白D的肽水平降低(表S2)。

图1：载脂蛋白多反应监测(MRM)测定。

结果2：西方饮食对血浆载脂蛋白组的影响

WD喂养使总胆固醇从3.1 mM上升到3.8 mM(p<0.05)(图2a)，但我们没有发现对甘油三酯的影响(图2b)。在整个脂蛋白组中观察到微妙的趋势，但在WD喂养的小鼠中，载脂蛋白A-IV显示出1.8的增长(P<0.0001)(图2e)。

图2：应用MRM检测方法对正常和高脂血症小鼠的血浆脂蛋白组进行分析。

对喂养小鼠和喂养WD小鼠的SEC分馏血浆进行胆固醇分析，证实了大部分胆固醇与高密度脂蛋白有关的脂蛋白谱(图2n，o)。载脂蛋白A-I、载脂蛋白A-II、载脂蛋白C-I、载脂蛋白C-III、载脂蛋白D和载脂蛋白M只与高密度脂蛋白一起洗脱，表明这些载脂蛋白在喂养的小鼠中具有高密度脂蛋白特异性(图2n，o)。除了与高密度脂蛋白一起洗脱外，大部分载脂蛋白A-IV与散装蛋白一起洗脱，表明很大一部分载脂蛋白A-IV以游离/非脂蛋白相关的形式循环(图2n,o)。以前的一项研究对喂养小鼠的载脂蛋白-I和载脂蛋白进行了分析，其洗脱图谱类似。

WD喂养对脂蛋白分布的主要影响是与高密度脂蛋白相关的载脂蛋白的比例发生了明显变化。在喂养的小鼠中，载脂蛋白在高密度脂蛋白和比高密度脂蛋白大的颗粒之间平均分布，而在WD喂养的小鼠中，大部分载脂蛋白与后者的颗粒相关(图2n,o)。

结果3：rAAV介导的肝脏D377Y-mPcsk9过量表达对血浆脂蛋白组的影响

与WD喂养的小鼠相比，D377Y-mPcsk9的肝脏过表达明显地提高了血浆胆固醇和甘油三酯水平(分别达到∼35和15mM)(图2a,b)，并且大部分血浆胆固醇与VLDL/CM/CMr和LDL峰值有关(图2p)。

通过脂蛋白分析，我们证实D377Y-mPcsk9过表达最突出的影响是载脂蛋白和载脂蛋白B-100(Ldlr的配体)增加了18倍(图2i,l,m)，它们与VLDL/CM/CMr和LDL峰有关(图2p)。这些发现与以前在Ldlr-/-小鼠中观察到的效果一致。

在喂养的小鼠中，ApoC-I、ApoC-III和ApoD仅限于HDL(图2n,o)，但在rAAV8-D377YmPcsk9处理的小鼠中，这些脂蛋白的很大一部分与LDL共溶，而且这些小鼠中ApoC-III和ApoD的总量增加了一倍以上(图2g,h,m)。

小鼠的遗传背景以前被证明会影响对rAAV8-D377Y-mPcsk9技术诱导的高脂血症的敏感性。为了进一步研究与品系相关的影响，比较了rAAV8-D377Y-mPcsk9处理的129Svj小鼠的血浆脂蛋白组。首先证实了129Svj小鼠对血浆胆固醇和甘油三酯的影响减少(图S4a,b)。比较总的脂蛋白水平，总胆固醇的差异似乎可归因于与ApoC-III、ApoD、ApoE和ApoB-100相关的脂蛋白(图S4g-i,l)，与这些脂蛋白的SEC分析显示它们与VLDL/CM/CMr和LDL峰值相关(图S4m,n)一致。尽管总的ApoC-I没有受到品系的影响(图S3f)，但ApoC-I在HDL和LDL之间的分布发生了明显的变化，因为在129Svj小鼠中几乎所有的ApoC-I都与HDL有关(图S3n)。

结果4：载脂蛋白缺失对血浆载脂蛋白组的影响

我们使用了ApoE−/−模型的载脂蛋白组，胆固醇和甘油三酯水平分别达到18和7 mM(图2a,b)，并主要在VLDL/CM/CMr峰值中被识别(图2q)。在ApoE−/−小鼠中无法测量ApoE肽，证实了检测的特异性(图2q)。

载脂蛋白e缺乏最深刻的影响是总载脂蛋白b增加10倍(图2k)，载脂蛋白a-iv增加5倍(图2e)。由于没有观察到对apob100特异性肽的影响(图2l)，对总ApoB的影响归因于在VLDL/CM/CMr和LDL峰值中识别的ApoB-48(图2q)。这一观察结果与这些颗粒的积累一致，它们需要ApoE在肝脏中进行lrp介导的清除我们还注意到，hdl显性载脂蛋白ApoA-I、ApoA-II和ApoM在ApoE−/−小鼠中显著降低(图2c,d,j,m)，这在之前已经报道过。

虽然与饲料喂养和饲料喂养的小鼠相比，aap-Ⅰ和aap-Ⅲ只受到轻微影响，但这些载脂蛋白从与HDL相关转变为主要存在于VLDL/CM/CMr和LDL颗粒上。

结果5：MRM分析在动脉组织载脂蛋白分析中的应用

我们测试了MRM测定法在第1和第2组福尔马林固定动脉标本上的适用性，评估了rAAV8-D374Y-mPcsk9处理的C57BL/6J小鼠(n=9)主动脉弓的易动脉粥样硬化内弯曲处的斑块，并将其与同一小鼠的降主动脉的相对抗动脉粥样硬化部位(n=8)进行比较。动脉粥样硬化的发展是肉眼可见的，并通过中性脂质染色证实(图3a)。除载脂蛋白D外，所有载脂蛋白均在斑块中富集，与未损伤的主动脉相比(图3b，c)。

图3：应用MRM分析方法对小鼠主动脉和动脉粥样硬化斑块中的载脂蛋白进行定量。

单独喂WD不足以诱导小鼠动脉粥样硬化，队列1中喂WD的小鼠(n=8)或喂WD(n=9)的小鼠的降主动脉的中性脂质染色显示明显存在沉积脂质(图3d)。然而，使用载脂蛋白MRM分析，我们在该位点检测到所有载脂蛋白，与标准中性脂质染色相比，MRM检测载脂蛋白的灵敏度更高。尽管ApoA IV是喂食WD的小鼠血浆中唯一显著升高的载脂蛋白(图2e，m)，但ApoA-I、ApoA II、ApoA-IV、ApoC-I、Apo E和ApoB-100在下降的胸主动脉中均显著升高(图3e)。接下来，我们通过将血浆中每个载脂蛋白的平均倍数变化除以胸主动脉降支的中位数效应来计算动脉富集指数(图3f)。该分析显示，与血浆相比，组织中的载脂蛋白含量大约增加了2倍，这表明动脉中测得的载脂蛋白质不仅反映了输注血浆，而且还反映了它们的延迟或固定。

在维管组织中定量载脂蛋白并非没有局限性。首先，我们不能区分从血液循环进入的载脂蛋白和由血管细胞局部产生的载脂蛋白。第二，归一化并不简单。在本研究中，当比较动脉粥样硬化和非病变动脉段之间的载脂蛋白组时，我们将其归一化为总蛋白，作为显示组织样本MRM检测应用的一种粗略方式。然而，由于斑块含有更多的蛋白质，我们很可能低估了图3b、c所示的差异。在MRM检测中加入丰富的“管家”蛋白(如Gapdh)进行归一化是进一步完善该检测以供未来应用的一种方法。综上所述，除了对载脂蛋白的相对滞留倾向提供新的见解外，MRM试验可能被用作一种替代和更敏感的方法来量化动脉壁的病理脂蛋白沉积。

在本文中，我们开发了一种高通量MRM检测方法，用于同时相对定量小鼠载脂蛋白。我们证明，这种小鼠测定可用于验证预期的，但也取决于疗法和基因型的新组合。此外，我们表明它可以应用于血浆和动脉组织。我们希望该测定法对一般的动脉粥样硬化领域以及对遗传和药理干预的全面表型分析都有价值。

Steffensen L B, Larsen J H, Hansen D R, et al. Profiling the Plasma Apolipoproteome of Normo-and Hyperlipidemic Mice by Targeted Mass Spectrometry[J]. Journal of Proteome Research, 2022.https://doi.org/10.1021/acs.jproteome.2c00189