题目：High throughput and high confidence sequence variant analysis in therapeutic antibodies using Evosep One liquid chromatography tandem mass spectrometry with synthetic heavy peptides期刊：Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis

影响因子：3.571

分类：抗体鉴定

发表日期：2022年7月

研究机构：Regeneron Pharmaceuticals Inc.

序列变异(SV)是指在DNA复制和蛋白质生物合成过程中，氨基酸错误地结合到治疗性抗体的一级结构中所引起的变异。这些低丰度变体导致的分子异质性可能对蛋白质治疗的安全性和疗效产生负面影响，因此使用液相色谱-串联质谱(LC-MS2)等分析方法对其进行监测，以制定控制策略，限制其发生。当前的LC-MS2策略依赖于相对较长的梯度，以最小化大量非变异肽峰和痕量变异之间的协同作用，从而限制可能隐藏后者的离子抑制。然而，液相色谱的长梯度减少了每天可分析的样品数量，限制了LC-MS2在分析大样本量时的实用性。此外，变异体鉴定可靠性取决于捕获丰富的MS2光谱的丰富程度，由于此类分析物的丰度较低，因此这项工作可能具有一定挑战性。与传统的LC-MS2分析相比，本研究通过将Evosep One LC平台与Orbitrap Fusion Lumos质谱仪集成，大大缩短了每个样本的鉴定时间。本研究还介绍了一种新的策略，即使用位于两个末端附近的含有重同位素的合成肽，根据与重肽变体共享的保留时间、前体质量信号和MS2片段模式，在一次目标LC-MS2运行中验证低置信度变体。

本研究通过对NISTmAb进行全局变异分析，并使用100SPD、60SPD、30SPD和15SPD的方法(分别为11.5、21.0、44.0和88.0分钟反相梯度)比较变异鉴定，来研究Evosep One对SV分析的适用性。进一步将结果与Waters Acquity超高效液相色谱仪(UPLC)上使用反相95.0 min梯度获得的鉴定结果进行比较。两种色谱仪都连接到同一台Orbitrap Fusion Lumos质谱仪上。使用重序列变异肽方法确认NISTmab和四种商业单克隆抗体中的序列变异体以验证本研究提出的新鉴定策略。

1. 使用Evosep One的11.5、21.0、44.0和88.0 min梯度进行NISTmAb序列变异分析比较

在Evosep One梯度和95.0 min Acquity I-Class UPLC梯度之间，通过六次重复DDA LC-MS2运行的Byonic搜索，比较识别的SV数量。图1a显示了每个已识别变体的氨基酸序列位置以及Byonic识别该变体的重复次数。在Evosep One 88.0 min梯度中，识别出27个变体，然后在44.0、21.0和11.5 min梯度中分别识别出24、14和7个SV(图1b)。Evosep One梯度上的变体重叠很高，如图1c所示，在较短的梯度上仅发现两个SV，是在88.0分钟的梯度中没有发现的。95.0分钟Acquity I-Class UPLC梯度识别出16个SV，平均3.5个重复中可以找到每个变体。与使用UPLC识别的序列变体相比，使用任何Evosep One梯度识别的序列变异体倾向于具有更高质量的MS2光谱，如图1d所示。

图1 使用四个Evosep One梯度和一个95.0 min Acquity I-Class UPLC梯度对六次DDA LC-MS2运行的Byonic搜索中识别的序列变异进行比较

使用Evosep One的88.0和44.0 min梯度识别SV在识别的变体数量、MS2光谱质量和循环时间方面优于传统UPLC。在之前的研究中，根据两个外部实验室获得的数据，进一步对其方法进行了基准测试。实验室1和2(图2a-d)中检测到的大多数变体也通过88.0和44.0 min Evosep One梯度识别，重叠率分别为60.0%和56.7%。这两个Evosep One梯度有助于额外的9个和7个SV鉴定，实验室1和实验室2均未报告。

图2 通过对Evosep One和Acquity I-Class UPLC梯度的Byonic搜索发现的序列变异与之前研究中两个单独实验室发现的变体进行比较

 在Evosep One梯度、95.0 min Acquity I-Class UPLC梯度和之前研究的两个实验室之间比较每种方法的检测SV水平及其相对丰度的重复性，以判断方法敏感性、梯度内和梯度间重复性以及与之前报告数据的可比性。图3检查了每个梯度中所有提取SV的百分比差异。图3a显示了总体趋势、百分比范围和变异百分比重叠。由于变异性较低，因此绘制每个Evosep One梯度和95.0 min UPLC梯度之间的变异百分比的绝对差异，结果观察到了Evosep-One梯度的其他定量波动(图3b)。88.0和44.0分钟Evosep One梯度的平均差异分别为0.0033%和0.0034%，最大差异为0.0148%和0.0151%。这两种方法在数量上彼此相似，也与UPLC方法相似。

图3 从每个梯度提取的序列变异百分比 

2. 利用重同位素肽验证不确定序列变异鉴定的新策略

序列变体分析有时受到不确定性的困扰，因为低丰度PTM和方法引入的伪影可能与变体序列错误匹配。为了直接解决不确定的SV特性，我们开发了一种新的策略，其特点是肽标准物带有重13C和15N标签，放置在C-和N-末端或附近，以便重SV标准物可以直接注射到抗体酶解液中，并在单次LC-MS2运行中提供RT、MS1和MS2比较。该方法很简单，如方案1a所示，其中匹配不确定SV候选序列的重型SV标准被添加到酶解液中，潜在SV可以通过RT、MS1信号和MS2片段识别和模式确认进行验证(方案1b)。

方案1 重肽序列变异验证方法

重型SV肽方法能够在不同复杂度的多个场景中进行稳健的SV验证。为了测试这种方法并证明其在这些情况下的优势，在NISTmAb和其他四种治疗性抗体的抗体肽摩尔浓度比~1:100时注射重型SV肽。图4为NISTmAb中确定的HC S307N变体的完美匹配示例。作为重标准物，SV候选变体在准确的RT下洗脱。SV肽的准确质量以及MS2与重标准物的比较进一步证实了这一点。在这种情况下，重标准物和SV产生了高度可比的MS2光谱，其变异位置由b-离子隔离，其余序列映射到富y-离子级联。

图4 使用重变异方法进行真阳性判别的典型示例

新的重型SV标准方法应用于NISTmAb中的六个SV候选变体和四个商业化mAb的六个其他SV候选变体，以确认它们是经验证的SV或假阳性。如表1所示，12个潜在变体中的10个使用我们的方案进行了确认，而其中两个候选变体显示为假阳性。这种方法不仅对SV候选验证有用，而且为分析员提供了额外的数据，且没有针与针之间的差异，以确定不明确情况下变体的位置，决定Ile和Leu变体，并在标准加入后量化SV。

表1 使用重序列变异肽方法确认NISTmab和四种商业单克隆抗体中的序列变异体

与当代方法工作流程相比，本文报道的两项进展提高了生物制药SV分析的通量和置信度。使用88.0和44.0分钟梯度在Evosep One LC上进行SV分析，可以提升通量，与UPLC上更长的LC梯度相比，识别的SV没有明显减少，MS2光谱分数也有所提高。重型SV标准方法可通过直接将标准溶液注入酶解液，通过RT、MS1同位素分布和MS2碎片模式确认候选变体，从而进一步提高此类分析的可信度。当存在多个氨基酸位置时，通过定位SV并区分Ile和Leu变异体，这种方法还可以实现更复杂的SV鉴定。我们预计，更高的SV分析结果加上重型SV标准方法将有利于生物制药行业，因为这将产生灵活而稳健的SV方法工作流，可以回答与SV特性和位点特异性相关的开发问题，并可以对突变体进行进一步研究。(生物网 www.mamobio.com)

Greer T, Johnson RO, Nie S, et al. High throughput and high confidence sequence variant analysis in therapeutic antibodies using Evosep One liquid chromatography tandem mass spectrometry with synthetic heavy peptides. J Pharm Biomed Anal. 2022;219:114925.