题目：High-throughput mass spectrometry maps the sepsis plasma proteome and differences in response期刊：MedRxiv

分类：蛋白组学

样本：血浆样本

发表日期：2022.08.09

研究机构：英国牛津大学纳菲尔德医学系韦尔康人类遗传学中心，英国剑桥大学韦尔康基因组校区韦尔康桑格研究所，英国牛津大学诺菲尔德医学系目标发现研究所。

败血症被定义为由于宿主对感染的反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍。目前，该疾病的高死亡率尚未找到有效的免疫调节疗法来解决。科学家根据临床表现、实验结果和分子鉴别，提出了对免疫应答状态、结果和治疗应答的败血症亚表型。然而，由于对败血症血浆蛋白质组的不完全了解，确定败血症宿主反应的性质受到了限制。串联质谱(MS)以非靶向和无假设的方式提供蛋白质测量，适用于发现败血症血液蛋白质组反应的表征。在这里，作者展示了使用高通量自动化和稳健的样品制备、基于质谱的数据采集和数据分析方法，使用液相色谱-质谱(LC-MS)平台在单个批次中分析了超过2500个未耗尽的血浆样品。作者报告了超过1000名成人败血症患者在多个时间点的血浆蛋白质组，并与白细胞转录组学整合，以深入了解败血症反应的性质和观察到的临床异质性。

TimsTOF质谱法

1. 用于高通量LC-MS/MS平台的等离子体样品制备

将来自8个队列的2622份临床血浆样品转移到28个96孔板中，然后用碳酸氢铵进行稀释。样品在室温下用DTT还原30分钟，后使用碘乙酰胺烷基化30分钟。

2. 生成血浆文库

为了增加血浆中蛋白质的检测范围并生成蛋白质文库，作者首先使用SepproIgY14柱来消耗前14个最丰富的血浆蛋白质，然后使用Seppro Supermix柱，创建了超消耗血浆。为确保蛋白质颗粒溶解，将样品在室温下混合20分钟，并在超声水浴中超声处理10分钟。使用Bravo Assaymap移液器将样品分馏成12个级分，将每个单独的级分加载到C18 EvoTips上，用于随后的LC-MS/MS分析。

3. LC_MS/MS使用高通量Evosep One-Bruker timsTOF Pro平台

使用连接到timsTOF Pro质谱仪的Evosep One LC系统分析样本。在1.2µl/min流量下，使用100个样品/天的方法分析肽，梯度为11.5分钟。以PASEF模式采集质谱数据。将离子迁移率窗口设置为1/k0开始=0.85 Vs/cm2至1/k0结束=1.3 Vs/cm2，质量范围100-1700 m/z。在4个PASEF帧(3个周期重叠)中获得MS/MS。目标强度设置为6000，阈值强度设置为200。

QE-HF质谱

1. 使用低通量平台(QE-HF)分析等离子体的样品制备

使用离心柱从急性炎症患者血浆中去除12种最丰富的蛋白质。然后使用TCA/DOC沉淀耗尽的血浆蛋白溶液。将肽注射到由Dionex Ultimate 3000nanoLC和Thermo Q-Extractive HF组成的LC-MS系统中。在50 cm长的EasySpray柱上分离肽，该柱内径为75µm，梯度为2-35%乙腈、0.1%甲酸和5%二甲基亚砜，梯度时间为60分钟，流速为250 nL/min。MS1光谱以60000的分辨率和3e6离子的AGC目标采集，最大注入时间为45ms。前12个最丰富的峰在分离后被碎片化，质量窗口为1.2次，分辨率为30000。归一化碰撞能量为28%(HCD)。

2. 发光分析

使用ProcartaPlex™ Luminex平台对来自GAinS研究的146名患者的204份样本中的65种炎症介质进行了测定，利用Luminex 100系统获取的数据，测量了3个96孔板的血浆样品。对每种分析物进行背景荧光校正，并确定定量的上下限(LOQs)。

3. 白细胞全基因组表达谱

对于本研究中包括的GAinS患者时间点，1354名(1010名患者)通过微阵列分析(518名患者，642份样本)、RNA测序(649名患者，837份样本)或两个平台获得配对白细胞基因表达数据。

1. 高通量质谱描述了危重病队列的血浆蛋白质组

作者旨在研究急性败血症血浆蛋白质组的特征。为此，分析了获得性肺炎(CAP)或粪性腹膜炎(FP)导致的败血症患者，并在患者住院期间连续取样，比较败血症与非感染性的炎症和危重疾病，从这些病例和对照中定义了发现和验证队列集。在这项研究中，作者开发了高通量定量蛋白质组学工作流程，使用Evosep One HPLC和Bruker timsTOF Pro的组合，对来自1612名个体(图1A)的2622份血浆样本进行了检测。

图1A. 研究设计、工作流程和队列

作者定制了数据预处理方案，以最小化潜在的技术偏差，并最大化样本之间的可比性。在该实验中，作者分析了源自FragPipe的原始蛋白质强度，确定了291种可靠检测的蛋白质。使用方差稳定化来归一化原始强度，并应用K-近邻来基于最相似的蛋白质或通过从下移正态分布中随机抽取剩余样本进行插补。经处理的数据包括1598名患者2575份样本中的269种蛋白质(图1A)。

2. 蛋白质组图谱揭示的跨队列严重性轴

作者首先试图了解所有队列中血浆蛋白丰度和富集度的变化。通过降低数据的维数，发现主成分(PC1)形成了从术前、术后和非感染性危重疾病到败血症和感染性休克的样本梯度(图1B)。在患者和对照组中，PC1高阳性负荷的蛋白包括S100促炎蛋白、先天免疫或抗菌蛋白和细胞外基质(ECM)蛋白(图1C)，基于蛋白质-蛋白质相互作用确定了富集用于生物过程的蛋白质簇。通过主成分分析所得矩阵，发现PC1在样本队列中显示出梯度，PC2涉及B细胞活化和Fc受体信号通路的调节(图1D)。

作者还衍生了蛋白质共表达网络，将184种蛋白质分为16个共表达模块，这些模块因对照队列而不同，并富集了急性期蛋白(蓝色模块，败血症中较高)、血浆脂蛋白(黄色，HV中较高)，血小板脱颗粒(棕色，败血症中较高)和免疫球蛋白(黑色、紫色和品红色，败血症和/或非感染ICU患者中较高)(图1E、1F)。

图1 B-G 血浆蛋白质组的研究概况和分化

3. 败血症与独特的血浆蛋白质组谱相关

作者继续研究败血症中差异蛋白丰度和途径富集。在六个败血症和对照组的对比中(图2A)，发现11种蛋白质在所有对比中差异丰富，所有蛋白质在败血症中均具有最高的丰度。这些包括急性期反应、细胞外基质、组织损伤保护，中性粒细胞功能、细胞因子产生和半乳糖代谢(图2B、2C)。与HV相比，在发现和验证队列中有53种蛋白质的差异丰度(图2B、2D)。作者进一步将败血症与反映无菌炎症反应的择期手术的术后样本进行了比较，并发现14种蛋白一致的差异丰度。其中，只有一种在败血症与HV对比中没有差异性丰度(图2B、2E)。

当作者将败血症患者与非感染患者进行比较时，发现和验证队列中有14种蛋白质的差异丰度(图2B、2F)。在发现队列中，败血症在急性期反应、中性粒细胞脱颗粒和IGF结合蛋白摄取的调节、先天免疫系统和翻译后蛋白修饰方面与所有对照组不同(图2G)。败血症患者与HV患者的免疫和代谢过程不同，败血症患者和术后患者之间没有差异。

图2. 败血症特异性蛋白质组学反应

4. 特异性血浆蛋白亚群与败血症严重程度、临床协变量、来源和进展相关

作者结合来自败血症发现和验证队列的样本，研究特定血浆蛋白是否与败血症反应的特定临床特征相关。作者首先分析了败血症患者蛋白质组的总体差异，结果显示，PC1与疾病严重程度相关的特征呈显著正相关;与血压、血小板和淋巴细胞比例呈显著负相关。在个体血浆蛋白丰度方面，确定了一组蛋白与反映更严重疾病的临床变量高度相关，而第二组具有强烈的负相关性(图3A)。与CAP患者相比，FP患者的五种蛋白明显更丰富(图3A、3B)。使用从所有队列中确定的蛋白共表达模块(图1E、1F)，发现特定模块与对照组对比度和特定临床变量显著相关(图3C、3D)。

图3. 败血症患者血浆蛋白质组的变化

5. 败血症亚型可从血浆蛋白质组中鉴定

接下来，作者从血浆蛋白质组中寻找败血症亚型的证据。使用所有时间点对败血症发现队列的蛋白质强度进行一致聚类(图1A)确定了三个亚组，该败血症血浆蛋白质组群代表了一致性指数累积分布显示的最佳群稳定性和数量(图4A-C)。随后，作者研究了这些聚类的临床相关性，发现SPC1包括临床上更严重的患者子集，休克和肾功能衰竭发生率更高(图4D)。SPC1患者在采样后28天和6个月的死亡率均显著高于SPC2和SPC3患者(图4E)。FP患者和早期时间点样本的SPC1富集，聚集为SPC1的患者呼吸功能更差，需要更多的呼吸支持，这表明SPC1在考虑了败血症的原始来源后识别出了更严重的患者。

随后，作者试图了解SPC之间的蛋白质组学差异。与HV相比，SPC1中的血浆蛋白具有明显的差异丰度。将差异丰度分析限制在SPC之间(图4F)，发现SPC1和SPC3中最丰富的蛋白质是泛素羧基末端水解酶15和胶原I型α-2链。与SPC2相比，SPC1显示出更高的免疫功能蛋白和免疫球蛋白丰度，以及更低的白蛋白、载脂蛋白、结合珠蛋白和细胞粘附介质。与SPC3相比，SPC2显示出较低的蛋白质丰度，特别是细胞内蛋白质(图4G)。

图4. 发现队列中的败血症血浆蛋白质组群(SPC)

6. 蛋白质组学患者亚组是可重复的，涉及特定途径和生物标志物

作者开发了SPC预测模型，并将该模型应用于败血症验证队列，复制了与死亡率(图5A)和严重程度相关的测量值，包括乳酸、细胞计数、血管加压素和肾支持以及SOFA评分(图5B)。验证队列集群和HV之间的差异丰度和路径富集分析显示与发现队列具有很强的一致性。作者导出了一个新的最小弹性网络模型，该模型成功分类了79.5%的测试集。作者还研究了团簇之间的跃迁。仅考虑具有多个可用时间点的526名患者，57.4%的患者随着时间的推移改变了组，最常见的是从SPC1到SPC3(图5C)。因此，SPC分配不仅可用于确定败血症反应状态和预测，还可用于治疗干预和监测疾病进展。

Evosep One timsTOF平台使作者能够分析大量的患者样本，但在可检测的蛋白质范围内存在限制。因此，采用了两种额外的方法来更全面地描述患者子集中的这些聚类。首先，作者在QE-HF质谱仪上分析了来自100名患者的148个败血症样本，确定了144种蛋白在SPC1和SPC3中的丰度较高，63种蛋白丰度较低(图5D)。途径富集分析再次强调了免疫反应途径、ECM组织和脂蛋白代谢。其次，作者使用Luminex免疫测定法对146名SPC患者的204份样本中的65种细胞因子和其他信号分子进行了研究。在第一个可用的时间点，大多数测量的分析物在SPC1和SPC3中的采样中值浓度较高，趋化因子显著增加;细胞因子参与B细胞增殖、免疫抑制功能和间质胶原酶MMP-1(图5E)。总体而言，SPC1的特点是免疫应答蛋白丰度较高，包括特异性细胞因子和免疫球蛋白，循环血浆中的胶原和ECM成分较多，这意味着这些患者的组织损伤程度更高(图5F)。

图5. 败血症血浆蛋白质组簇(SPC)的验证和分子特征

7. 血浆蛋白质组和白细胞转录组的整合揭示了导致败血症反应的成分

作者试图通过整合837个样本(649名患者)的配对白细胞转录组学(RNAseq)来最大化败血症血浆蛋白质组学(MS)的信息量，使用矩阵分解得出284个潜在成分。随后，作者测试了284个成分与临床严重程度、患者亚组、病因和时间点的相关性(图6)。与疾病严重程度最显著相关的两个成分仅涉及差异基因表达，并涉及代谢和免疫过程。相比之下，成分141将较低的SOFA分数与富含HLA II类和脂质生物学相关蛋白和富含组氨酸糖蛋白的基因联系起来，这些基因总体上富集于内肽酶活性，血小板脱颗粒和补体激活的的负调控(图6B)。第二重要的组成部分266是免疫球蛋白可变链和恒定链的多个差异表达基因和同源蛋白的相关贡献，以及FP中受体介导内吞作用的富集结果(图6C)。组分241具有第三高的意义，与涉及PRSS8、CD5L和FN1的蛋白相关;参与由基因表达负荷指示的趋化性和信号通路的调节(图6D)。组分160将较高的SRSq与蛋白质相连接，所述蛋白质包括COLEC11、CRP、DEFA1、LBP、ECPAS、CPN2，以及来自富含分泌可溶性因子、GPCR配体结合的基因，中性粒细胞脱颗粒和免疫调节相互作用(图6F)。

总的来说，基质分解分析确定了与败血症严重程度、疾病病因、进展和亚型相关的血浆蛋白质组和白细胞转录组的特征;在某些情况下，由蛋白质组学或转录组学特征主导，而在其他情况下，跨这些域连接特征。

图6. 血浆蛋白质组学和白细胞转录组学的整合

8. 转录组学和蛋白质组学分析揭示了互补但不同的败血症亚型和反应状态

作者通过分析1016名患者，进一步探讨了血浆蛋白质组和白细胞转录组衍生的败血症亚型之间的关系。考虑到第一个可用时间点，发现队列中70%的SPC1患者被分配到SRS1，而SPC2和SPC3中分别为37%和34%。作者鉴定了SRS组之间差异丰富的蛋白质(图7C)，其中一些与区分SPC1和SPC2+3的蛋白质重叠(图7D)。免疫球蛋白HP和APOA2仅在SPC之间存在差异，SRS组和SPC组之间的基因表达差异高度相关。考虑到SRS1和SPC1均与不良结果相关(图7E)，作者测试了两种分类是否可以结合，以进一步进行风险分层。结果表明，分配给SRS1和SPC1的患者(约11%的患者)在28天时死亡率最高，为33.3%，风险比(HR)=3.9，而“SPC3非SRS1”患者的死亡率最低，为10.4%(12.8%)(图7F)。

图7. 蛋白质组(SPC)和转录组(SRS)患者亚群的相互作用

在这项研究中，作者绘制了人类败血症血浆蛋白质组图，应用了创新的基于质谱的方法，以了解败血症与健康、无菌炎症状态和非感染危重疾病以及败血症反应的个体差异。败血症血浆蛋白质组反映了宿主对感染反应失调的机制，以及器官功能障碍和组织损伤的更广泛后果。这为确定发病机制的新方面以及器官功能障碍和疾病严重性的测量提供了机会。

作者报告了败血症中特异性蛋白、共表达模块和网络差异丰富的证据，涉及先天免疫、急性期反应、中性粒细胞功能、细胞因子产生、脂肪代谢、组织损伤保护和细胞外基质组织。发现了基于临床和实验室变量、炎症介质和白细胞转录组的败血症亚型证据。作者从败血症血浆蛋白质组中确定并验证了三个患者群，为反应状态、疾病严重程度和结果提供信息。作者进一步展示了基质分解如何整合成对的血浆蛋白质组学和白细胞转录组学数据，证明了这些数据在特定成分中相互关联，并为疾病严重程度或疾病亚组提供信息。结果表明，在单个LC-MS平台上，在单个批次中跨多个大队列的中高通量蛋白质组学是可行的。一种简单的半自动样品制备策略，结合以100个样品/天的速度对超过2500个临床、未耗尽血浆样品和进一步的约2000个质量控制和文库样品进行MS分析，现已达到其他蛋白质组学技术(如Olink或SOMAscan)所采用的通量，但成本和样品使用率显著降低。同时，基于LC-MS的血浆样本蛋白质组学分析可以在不影响临床、患者特异性测量的情况下，对新的生物标志物进行无偏见的发现分析。未来的工作将集中于简化样本和数据处理工作流程，以实现临床认证和护理点的使用。

败血症是宿主对感染的失调反应，导致危及生命的器官功能障碍，是一个尚未解决的全球健康挑战。作者应用高通量串联质谱来描绘败血症和对照组(非感染危重疾病、术后炎症和健康志愿者)的血浆蛋白质组，涉及单批2622个样本和4553个液相色谱-质谱分析，展示了这种规模的数据如何在败血症中建立共享和特异的蛋白质、通路和共表达模块，并使用矩阵分解与配对白细胞转录组数据(n=837个样本)整合。作者绘制了败血症中宿主反应的图景，包括随时间的变化，并确定了与病因、临床表型和严重性相关的特征。这项工作揭示了败血症反应状态、疾病过程和结果的新亚表型，强调了潜在的生物标志物、药物靶点的途径和过程，并提出了一种基于系统的败血症精确医学方法。(生物网 www.mamobio.com)

Mi, Yuxin, et al. "High-throughput mass spectrometry maps the sepsis plasma proteome and differences in response." medRxiv (2022).