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Newomics MnESI离子源助力单克隆抗体的电荷异质性表征

发布:大分子生物 阅读量: 抗体 2022-10-06

Title:Coupling Anion Exchange Chromatography with Native Mass Spectrometry for Charge Heterogeneity Characterization of Monoclonal Antibodies

题目:阴离子交换色谱-自然质谱联用表征单克隆抗体的电荷异质性

Journal:Analytical chemistry

Date: 2022.04

Abstract:

Despite the recent success of coupling anion exchange chromatography with native mass spectrometry (AEXMS) to study anionic proteins, the utility of AEX-MS methods in therapeutic monoclonal antibody (mAb) characterization has been limited. In this work, we developed and optimized a salt gradientbased AEX-MS method and explored its utility in charge variant analysis of therapeutic mAbs. We demonstrated that, although the developed AEX-MS method is less useful for IgG1 molecules that have higher isoelectric points (pIs), it is an attractive alternative for charge variant analysis of IgG4 molecules. By elevating the column temperature and lowering the mAb pI through PNGase F-mediated deglycosylation, the chromatographical resolution from AEX separation can be significantly improved. We also demonstrated that, after PNGase F and IdeS digestion, the AEX-MS method exhibited excellent resolving power for multiple attributes in the IgG4 Fc region, including unprocessed C-terminal Lys, Nglycosylation occupancy, and several conserved Fc deamidations, making it ideally suited for multiple attribute monitoring (MAM). Through fractionation and peptide mapping analysis, we also demonstrated that the developed AEX-MS method can provide sitespecific and isoform-resolved separation of Fc deamidation products, allowing rapid and artifact-free quantitation of these modifications without performing bottom-up analysis.

研究背景

电荷异质性通常由许多翻译后修饰引起,被认为是治疗性单克隆抗体(mAbs)的一个关键质量属性,因此,需要在整个药物开发阶段进行彻底表征和监测。大多数上市的单抗分子往往是相对基本的,这使得阴离子交换色谱法(AEX)并不常用于单抗电荷异质性分析。大多数上市的治疗性单克隆抗体属于IgG1亚类,其pIs往往较高(>7.5)。然而,现今IgG4分子作为治疗候选者发挥着越来越重要的作用,往往具有较低的pIs,这使得它们可能适合用AEX-MS方法进行分析。在本研究中,我们开发并优化了一种基于盐梯度的AEX-MS方法,并探索了其在治疗性单克隆抗体电荷异质性表征中的实用性。

实验方法

在本研究中,我们开发并优化了一种基于盐梯度的AEX-MS方法。AEX色谱在配备UltiMate 3000 PCM-3000 pH和电导率监测器的UltiMate3000 UHPLC系统上进行。使用Thermo Q Exactive UHMR,配备微流纳米喷雾电喷雾电离(MnESI)源和微制造单片多喷嘴(M3)喷针(Newomics,Berkley,CA)进行Native MS分析。探索了AEX-MS在治疗性单克隆抗体电荷异质性表征中的实用性。在方法开发过程中,我们评估了不同的洗脱模式、柱操作温度和样品处理,以提高色谱分辨率。对来自IgG1和IgG4亚类的多个具有广泛pIs的mAb分子进行了测试,以评估方法的适用性。

研究结果

1、开发非变性AEX-MS方法

我们开发的平台可耐受高盐浓度(高达600 mM醋酸铵),在使用不同流动相的不同洗脱模式下测试AEX-MS方法具有很大的灵活性。最初,我们测试了盐介导的pH梯度,从pH 9.0的10mM醋酸铵到pH 4.0的50mM醋酸铵。接下来,我们使用10 mM醋酸铵作为流动相a,300 mM醋酸铵盐作为流动相B,在不调整pH值的情况下,评估了纯盐梯度(图1)。

图1. 开发的非变性AEX-MS方法的实验装置示意图

图1. 开发的非变性AEX-MS方法的实验装置示意图

2、AEX-MS法的柱温优化

AEX-MS分别在25、35和45°C的柱温下测试了两种mAb分子(pI=6.6的mAb-A和pI=6.8的mAb-B),以研究对mAb保留和分离的影响。对于我们的AEX方法,随着柱温从25°C增加到45°C,两个mAb分子都显示出明显改善的变异分离以及更尖锐的峰(图2)。由于在45°C下的色谱分辨率提高,两种单克隆抗体的碱性和酸性变体可以很容易地识别和定量。因此,选择45°C的柱温进行完整mAbs的AEX-MS分析。

图2. 在25°C(蓝色迹线)、35°C(橙色迹线)和45°C(红色迹线)的柱温下,通过天然AEX-MS分析(a)mAb-a(pI=6.6)和(b)mAb-b(pI=6.8)得到的TIC迹线。

图2. 在25°C(蓝色迹线)、35°C(橙色迹线)和45°C(红色迹线)的柱温下,通过天然AEX-MS分析(a)mAb-a(pI=6.6)和(b)mAb-b(pI=6.8)得到的TIC迹线。

3、AEX-MS方法适用性评估

为了测试方法的适用性,对七种内部单克隆抗体(IgG1和IgG4亚类)和NISTmAb(pIs范围为6.1至9.2)进行了本地AEX-MS分析。生成的总离子色谱图(TIC)如图2所示,其中根据准确的质量测量和经验知识对每个分离的变异峰进行标记和识别。正如预期的那样,具有较低pIs的单克隆抗体分子实现了更好的变异分离。虽然开发的天然AEX-MS方法不适用于高pIs的IgG1分子,但它广泛适用于中等pIs IgG4基分子,并且与其他方法相比具有一些独特的选择性。

图2. (a)不同单抗分子(5μg注射液)的天然AEX-MS分析的TIC轨迹,pI值在6.1到9.2之间。(b)TIC轨迹的放大视图显示在右侧。

图2. (a)不同单抗分子(5μg注射液)的天然AEX-MS分析的TIC轨迹,pI值在6.1到9.2之间。(b)TIC轨迹的放大视图显示在右侧。

4、CEX-MS和AEX-MS方法的比较

为了证明开发的AEX-MS方法在酸性场景中的实用性,使用CEX-MS(图3a)和AEX-MS方法(图3b)分析了pI=6.8的基于IgG4的单抗分子。结果显示,对于这种基于IgG4的mAb分子,AEX-MS方法与CEX-MS方法相比,显示出更好的变体分离,从而能够更灵敏、更可靠地描述电荷异质性。因此,对于pIs较低且未被CEX很好分离的单抗分子,AEX-MS方法可能是一种有吸引力的替代方法。由于AEX-MS方法对Fc-N-糖基化和脱酰胺具有独特的选择性,因此也可以与CEX-MS方法并行应用,以实现更全面的电荷异质性表征。

图3. IgG4单克隆抗体(pI=6.8)的(a)CEX-TIC和(b)AEX-TIC比较。

图3. IgG4单克隆抗体(pI=6.8)的(a)CEX-TIC和(b)AEX-TIC比较。

5、通过PNGase F介导的去糖基化提高AEX-MS分辨率

在AEX-MS方法适用性评估过程中,发现对于具有较低pIs的单抗分子,AEX分离效果更好。因此,我们试图探索通过PNGase F介导的脱糖反应降低单抗pIs来提高AEX分离的可能性。结果表明,即使在去除Fc-N-聚糖之后,该AEX-MS方法仍然可以有效地表征Fc-糖基化宏观异质性。由于提高了色谱分辨率,在PNGase F处理后,成功地识别出之前AEX-MS方法检测不到的几个小变异(图4)。因此,PNGase F介导的脱糖基化被证明是提高AEX-MS方法色谱性能的有效方法。

图4. PNGase F处理前(蓝色虚线)和处理后(黑色实线)对(a)mAb-3、(b)mAb-4和(c)mAb-8的天然AEX-MS分析的TIC示踪。

图4. PNGase F处理前(蓝色虚线)和处理后(黑色实线)对(a)mAb-3、(b)mAb-4和(c)mAb-8的天然AEX-MS分析的TIC示踪。

6、AEX-MS方法在IgG4抗体属性监测中的应用

我们评估了AEX-MS方法在基于IgG4的单抗亚单位分析中的应用。如图5a所示,AEX-MS对mAb-4释放的IdeS和脱糖基Fc片段的分析显示出四种基本变体(B1、B2、B3和B4)和两种酸性变体(A1和A2),它们都是基线分辨的。对B1、B3和主峰进行分馏,用胰蛋白酶消化,并进行LC-MS/MS分析(图5)。为了促进分馏,在IdeS消化和脱糖基化后,对含有显著升高脱酰胺水平的热应激IgG4 mAb-8进行AEX-MS分析(图6)。与完整单克隆抗体水平的分析相比,对Fc片段的AEX-MS分析在分离这些脱酰胺变体方面显示出了极大的提高分辨率。在Fc水平上实现脱酰胺产物的位点特异性和亚型分辨分离的能力令人兴奋,因为它提供了一种简单的方法来监测这些属性,而无需执行肽图谱分析,这是一种耗时且已知会引入脱酰胺伪影的方法。因此,研究表明,开发的天然AEX-MS方法是IgG4-Fc属性监测的一项强大技术,能够方便地表征未处理的C末端Lys、N-糖基化占有率以及位点特异性和异构体分解脱酰胺。

图5.(a)来自mAb-4(IgG4)的IdeS释放和脱糖基Fc片段的AEX-MS分析的TIC轨迹。(b) Main、B1和B3组分肽图分析得到的天然和脱酰胺形式的含Fc N-糖苷的胰蛋白酶肽(EEQFNSTYR)的XIC。

图5.(a)来自mAb-4(IgG4)的IdeS释放和脱糖基Fc片段的AEX-MS分析的TIC轨迹。(b) Main、B1和B3组分肽图分析得到的天然和脱酰胺形式的含Fc N-糖苷的胰蛋白酶肽(EEQFNSTYR)的XIC。

研究结论

1. 虽然开发的AEX-MS方法对具有较高等电点(pIs)的IgG1分子不太有用,但对于IgG4分子的电荷变体分析来说,它是一种很有吸引力的替代方法。

2. 通过PNGase F介导的脱糖基化,提高柱温并降低mAb pI,可显著提高AEX分离的色谱分辨率。

3. 在PNGase F和IdeS消化后,AEX-MS方法对IgG4-Fc区域的多个属性显示出良好的分辨率,包括未处理的C末端Lys、Nglycosylation占有率和几个保守的Fc脱酰胺,使其非常适合于多属性监测(MAM)。

4. 我们开发的AEX-MS方法可以提供Fc脱酰胺产物的位点特异性和亚型分辨分离,允许在不进行自下而上分析的情况下对这些修饰进行快速无伪影定量。

参考文献

Liu AP, Yan Y, Wang S, et al. Coupling Anion Exchange Chromatography with Native Mass Spectrometry for Charge Heterogeneity Characterization of Monoclonal Antibodies. Anal Chem. 2022;94(16):6355-6362.


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