Title：Post-Column Denaturation-Assisted Native Size-Exclusion Chromatograph-Mass Spectrometry for Rapid and In-Depth Characterization of High Molecular Weight Variants in Therapeutic Monoclonal Antibodies

题目：柱后变性辅助天然尺寸排除色谱法−治疗性单克隆抗体中高分子量变体的质谱快速、深入表征

Journal：American Chemical Society

Date: 2021.11

Abstract：

The high molecular weight (HMW) size variants present in therapeutic monoclonal antibody (mAb) samples need to be closely monitored and characterized due to their impact on product safety and efficacy. Because of the complexity and often low abundances in final drug substance (DS) samples, characterization of such HMW species is challenging and traditionally requires offline enrichment of the HMW species followed by analysis using various analytical tools. Here, we report the development of a postcolumn denaturation-assisted native SECMS method that allows rapid and in-depth characterization of mAb HMW species directly from unfractionated DS samples. This method not only provides high-confidence identification of HMW complexes based on accurate mass measurement of both the intact assembly and the constituent subunits but also allows in-depth analysis of the interaction nature and location. In addition, using the extracted ion chromatograms, derived from high-quality, native-like mass spectra, the elution profiles of each noncovalent and/or nondissociable complex can be readily reconstructed, facilitating the comprehension of a complex HMW profile. The utility of this novel method was demonstrated in different applications, ranging from enriched HMW characterization at late stage development, comparability assessment due to process changes, and forced degradation study of coformulated mAbs. As this method does not require prior enrichment, it is thus desirable for providing both rapid and in-depth characterization of HMW species during the development of therapeutic mAbs.

研究背景

由于mAb 高分子量(high molecular weight, HMW)种类的不同(从可溶性低聚物到可见粒子)可能会引发不必要的免疫原性反应和/或改变其药代动力学行为，从而影响药物的安全性和疗效，因此需要在整个产品生命周期中对HMW种类进行详细表征、持续监测和控制。然而，第一，作为一种非变性方法，与预期的低聚种类类(如二聚体、三聚体、四聚体等)相比，nSEC-MS分析无法区分非共价结合和共价结合HMW络合物。第二，仅通过完整的质量测量通常无法确定非常规HMW种类的可靠鉴定。为了克服这些挑战，我们描述了一种新的柱后变性辅助nSEC-MS方法(PCD-assisted nSEC-MS)，该方法经过优化，可将SEC分解的非共价单抗HMW种类分解为片段，用于后续的MS检测。

研究方法

在配备Acquity BEH200 SEC柱(4.6×300 mm，1.7μm，200á;Waters，Milford，MA)的UltiMate 3000 UHPLC系统上进行天然SEC色谱，柱室设置为30°C。以0.2 mL/min的速度等速流动150 mM醋酸铵，以分离和洗脱蛋白质大小变体。为了实现柱后变性，由60%ACN、36%水和4%FA组成的变性溶液由二次泵以0.2 mL/min的流速输送，然后使用T型混合器与SEC洗脱液混合(1:1混合)，然后进行MS检测。为了实现在线原生质谱分析，将组合分析流(0.4 mL/min)分成微流(<10μL/min)，用于纳米电喷雾离子化(NSI)-MS检测，并将剩余的高流量用于UV检测(图1)。使用Thermo Q Exactive UHMR，配备微流纳米喷雾电喷雾电离(MnESI)源和微制造单片多喷嘴(M3)喷针(Newomics，Berkley，CA)进行原生质谱分析。为了禁用PCD，将变性溶液的流量设置为零。使用Acquity BEH200 SEC保护柱(4.6×30 mm，1.7μm，200º)以类似方式对部分还原的mAb1进行脱盐SEC-MS分析。

图1. PCD辅助nSEC MS平台方案

研究结果

1、柱后变性辅助nSEC-MS方法

为了改进基于nSEC-MS的单克隆抗体HMW种类特征，引入柱后变性(PCD)策略，在质谱检测之前分离SEC分离后的非共价HMW复合物。在评估了一系列含有不同水平乙腈(ACN)和甲酸(FA)的变性溶剂系统后，选择了一个由60%ACN、4%FA和36%水组成的优化配方用于PCD应用。结果表明低pH值和有机溶剂的组合在破坏非共价相互作用方面更为有效。(图2a和b)。

图2. (a) 在天然(黑色痕迹)或PCD条件(橙色和红色痕迹)下获得的部分还原mAb1(链间二硫键断裂)的质谱。(b) 在天然(黑色痕迹)或PCD(橙色和红色痕迹)条件下获得的mAb2二聚体的质谱。

2、富集的HMW样本的PCD辅助nSEC-MS分析。

作为DS异质性表征的一部分，在项目开发的后期，通常需要扩展mAb HMW种类的表征。通常对富集的HMW材料进行有限的酶消化(例如IdeS消化)，然后进行完整的质量分析，以了解亚结构域水平的相互作用界面。为了减少歧义并改善特征，在SEC分离后实施了PCD，以提供基于交互性质的第二维度分离(图3)。

图3.在IdeS消解后，对富含mAb3的HMW样品进行nSEC UV/MS分析，显示SEC-UV轨迹(中央面板)、峰分配以及在自然(蓝色轨迹)或PCD(红色轨迹)条件下获得的每个HMW峰的反卷积质谱。

3、PCD辅助nSEC-MS分析未分馏DS样品中的HMW种类

对一个在SEC分离过程中表现出复杂HMW轮廓(四个部分分解的HMW峰)的双特异性抗体DS样品进行了分析，结果显示，直接从未分离的DS样品中阐明HMW种类的能力使PCD辅助的nSEC MS方法非常适合于工艺开发支持，其中需要快速周转以促进决策(图4)。为了测试该领域的实用性，然后应用该方法评估工艺变更前后单抗程序HMW谱的可比性(图5)。

图4. 对bsAb DS样本进行nSEC-UV/MS分析，显示SEC-TIC(左，左侧面板，红色和黑色痕迹)以及在自然(黑色痕迹)或PCD(红色痕迹)条件下获得的每个HMW峰的原始质谱。

图5. 使用PCD辅助nSEC UV/MS分析，在(a)完整水平和(b)子域水平(IdeS消化后)表征mAb4 DS批次1和批次2的HMW谱。

4、PCD辅助nSEC MS分析共配制的单克隆抗体样品中的杂分子间相互作用

在整个开发过程中，在储存或稳定条件下，对共配制单抗药物产品(DP)样品(例如，含有一个以上治疗性单抗)中形成的HMW种类进行表征非常重要。然而，由于这些样品中经常存在高度复杂的HMW分布，涉及分子间的均分子相互作用和异分子相互作用，因此这种分析提出了独特的分析挑战。为了应对这些挑战，在研究中还评估了PCD辅助的nSEC-MS方法的效用，以支持共同制定单克隆抗体计划的发展。例如，在加速稳定性条件下测试由两个mAb(mAb-a和mAb-B)组成的共配DP样品。采用 PCD辅助nSEC MS分析方法，结果表明，在加速稳定性条件下，mAb-A和mAb-B之间的分子间异相互作用是有利的，可能通过共价交联或紧密但非共价的相互作用(图5)。

图6. 在(A)T0和(B)25°C条件下，在自然(黑色痕迹)和PCD(红色痕迹)条件下，使用nSEC MS在共配制的mAb-A和mAb-B样本中检测到六个月的HMW种类。

研究结论

1. 确认了与非共价HMW复合物分离的组成亚单位，改进了异构HMW种类的鉴定。

2. 通过消除共溶化非共价种类的干扰，实现不可分离HMW种类的更精确质量测量。

3. 通过结合有限的酶消化步骤，PCD辅助的nSEC-MS方法可以很容易地在子域水平揭示单抗聚集体的相互作用性质和相互作用界面。

4. 在不同的案例研究中证明了该方法的实用性，包括开发后期富集的HMW特征、工艺变化引起的可比性评估以及共配制单克隆抗体的强制降解研究。

我们证明，这种PCD辅助的nSEC MS方法是一种强大的工具，不仅可以从富集的HMW样本中，也可以从HMW含量较低的普通DS样本中，快速、深入地表征单克隆抗体HMW种类。

参考文献：

Yan Y, Xing T, Liu AP, et al. Post-Column Denaturation-Assisted Native Size-Exclusion Chromatography-Mass Spectrometry for Rapid and In-Depth Characterization of High Molecular Weight Variants in Therapeutic Monoclonal Antibodies. J Am Soc Mass Spectrom. 2021;32(12):2885-2894.