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AAV前处理对滴度检测的影响

发布:大分子生物 阅读量: 基因治疗 2022-10-06

文献题目:Accurate Quantification and Characterization of Adeno-Associated Viral Vectors

出处:ORIGINAL RESEARCH

发表时间:17 July 2019

QPCR 已成为AAV 载体定量最广泛使用和接受的方法,因为它在理想条件下简单且稳定。其局限性在于 DNA 扩增效率和标准品的获得。扩增效率可能会受到不同因素的影响,包括引物对设计不佳、抑制剂的存在或模板中的二级结构。数字 PCR 最近已成为一种强大的 AAV 绝对定量技术,这种方法可以消除对标准曲线的依赖,并且对抑制剂不太敏感。两种检测方式各有优缺点,但相同的是都依赖一个稳定的前处理方式。在《Accurate Quantification and Characterization of Adeno-Associated Viral Vectors》中就比较了几种前处理方式,我们不妨来看。

材料来源

此研究使用 AAVrh.10 载体,基因组成由:AAV2 5 'inverted terminal repeat (ITR), the AAV2 packaging signal (C), CMV enhancer, chicken β-actin promoter and splice donor and rabbit β-globin intron with splice acceptor, the cDNA for the transgene followed by the rabbit β -globin polyA signal, and the AAV2 3' ITR。

四种前处理

(1)样品直接使用(无预处理)

(2)蛋白酶 K 处理

蛋白酶 K 反应由蛋白酶 K (Qiagen, Germany)、0.5 M EDTA (Sigma Aldrich, United States)、10% SDS (Sigma-Aldrich, United States) 和无核酸酶水 (NFW) 组成。在 55°C 的恒温摇床上孵育 60 分钟,以 650 转/分的速度摇动,之后在 95°C 孵育 15 分钟后失活。

(3)DNase 消化

此过程总是在任何其他处理之前,并且每个反应仅使用四个units。

DNase 反应混合物由 Ambion DNase I Buffer (Thermo Fisher Scientific, United States)、无核酸酶水 (NFW)、样品和不同浓度的 Ambion DNase I (Thermo Fisher Scientific, United States)组成。将混合物轻轻混合并在 37°C 下孵育 30 分钟。

通过变性步骤从衣壳中释放基因组并释放二级结构,其中样品在 95°C 下孵育 15 分钟并缓慢冷却至室温.

(4)从载体上切下 ITR 区域,以降低衣壳变性后二级结构的稳定性。

使用 0.5 µL SalI 限制酶(New England Biolabs,美国)和 22 µL 限制缓冲液(New England Biolabs,United States)进行载体限制性消化。反应混合物在 37°C 下孵育 60 分钟,然后在 65°C 下灭活 20 分钟。

QPCR反应体系

最终体积为 10 µL 的反应混合物由 5.5 µL TaqMan 2× Universal PCR Master Mix(Life Technologies)、0.5 µL 引物和探针混合物(引物的最终浓度为 900 nM 和探针 250 nM)组成, 2 µL 的 NFW 和 2 µL 的 DNA 或 AAV 模板。

数字CPR反应体系

数字PCR的反应混合物由 10 µL 2×Supermix 用于探针(无 dUTP)(Bio Rad)、1 µL 引物和探针混合物(引物的最终浓度为 900 nM 和探针 250 nM)组成, 4 µL 的 NFW 和 5 µL 的 AAV 样品。

检测结果比较

QPCR 和 数字PCR 的变异性根据不同预处理的最小和最大值(四个重复)之间的检测结果的倍数差异进行评估。QPCR 分别评估了初始样品的两个稀释度(高浓度和低浓度;10 倍差异)。结果显示QPCR 的范围为 1.4× 至 3.2×,数字PCR 的范围为 1.1× 至 1.6×;数字PCR的变异性更小。

AAV前处理对滴度检测的影响(图1)

同时比较QPCR 和 数字PCR 不同处理的最小值和最大值之间的倍数差异如图 1 显示。QPCR为 7.7 倍,而数字PCR显示为2.4 倍。根据实验结果建议使用 DNase 消化作为预处理。

AAV前处理对滴度检测的影响(图2)

为确定去除未包壳 DNA 所需的最低 DNase 酶水平,我们在 ddPCR 之前对 AAVrh.10hCLN2 样本测试了六种不同浓度的 DNase(每个反应 0、2、4、8、10 和 20 个units)。

AAV前处理对滴度检测的影响(图3)

在 2 个units水平,观察到载体基因组滴度显着下降(图 2),表明存在游离 DNA。DNase 浓度的进一步增加对确定的载体基因组滴度没有任何显着影响(图 2),表明实验中使用的 DNA 酶可能没有非特异性蛋白酶活性。

导致不同载体基因组滴度的预处理和测定

针对 AAVrh.10hCLN2 构建体中的一系列序列(图 3)的更多测定提供了载体 DNA 完整性和基因组中目标位置影响的测量。

我们比较了所有测定与 qPCR 和 ddPCR 在相同起始材料上的反应,在 PCR 之前经历了不同的处理:

(1)仅 DNase 消化

(2) DNase 消化和衣壳变性

(3) DNase 消化,衣壳变性和 ITR 区域限制

AAV前处理对滴度检测的影响(图4)

对于仅用 DNase 处理的样品,确定了最低的载体基因组滴度。这也是在所有测定和两种 PCR 技术中确定的载体基因组滴度没有显着差异的唯一处理(图 4)。同一组还包括 ddPCR CMV 测定的 DNase 和变性处理。

参考文献:

Accurate Quantification and Characterization of Adeno-Associated Viral Vectors doi: 10.3389/fmicb.2019.01570


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