文章名称：Plasma proteomics goes high throughput–timsTOF Pro with PASEF and 4D feature alignment to quantify 500 plasma proteins in 11.5 min

Abstract:

Blood analysis is one of the most commonly performed proce-

dures in medicine, where clinical parameters are used for diagnosis and for decision on treatment options. Currently biomarkers are typically derived from enzymatic or immunoassays and lack comprehensiveness. LC-MS/MS based proteomics has long been a powerful research tool but has not provided the robustness and throughput to decipher new biomarkers in large cohort studies of blood plasma. Here, we have combined the robustness and speed of the timsTOF Pro with PASEF together with the high throughput LC-separation provided by the Evosep One to analyze 100 ng samples of blood plasma from 192 severe infection patients at a sampling rate of 100 runs per day (11.5 min gradient). After every 10th we include QC sample (20 total) to monitor the LC-MS/MS performance. We found high quantitative reproducibility across the study (R2 > 0.97, median CV 9.3%) and no systematic drift in peptide and protein identification. We utilized PEAKS X software (Bioinformatic Solutions) which aligns features in four dimensions; retention time, intensity, m/z and ion mobility to transfer identifications in a match between run design. In utilizing this alignment approach we dramatically improve the number of quantified proteins from 188 to 500 protein groups on average per run. This depth of quantification is often not even achieved on LC-MS/MS runs of several hours in length. In the sample set we found several proteins of intermediate or lower abundance (CRP , PSA, IFN-γ), demonstrating that this workflow can facilitate biomarker discovery even at medium to low abundance analyte levels. Taken together, we provide a robust and high throughput LC-MS/MS solution with sufficient depth for unbiased discovery of new biomarkers in samples of blood plasma relevant to clinical applications.

血液、血浆和血清是临床诊断分析中最常用的样本，因为它们易于获得;它们通常从患者身上收集，也可以从临床研究中通过生物库获得。常规临床诊断是用免疫分析法进行定量分析，然而，这些方法在可以同时测量的蛋白质或其他分析物的数量上受到限制。免疫测定法的使用仅限于验证，不能用于临床研究的发现阶段。质谱(MS)为基础的蛋白质组学是免疫测定的一种有吸引力的替代方法，可用于生物标志物的发现和验证。然而，基于质谱的血浆蛋白质组学具有极大的挑战性，主要挑战之一是蛋白质丰度的大动态范围，此外，在大规模队列中为生物标志物发现和验证实现可复制、健壮和高通量蛋白质组学工作流程的困难。作者开发了一种健壮且高度精简的等离子蛋白质组学工作流，用于大样本队列的分析，将非常短(LC)-MS/MS梯度与快速扫描质谱分析以及优化的无标签定量管道相结合。这允许为临床样本生成高通量血浆图谱，从而在有意义的时间轴内提供对这些患者健康/疾病状态的有价值的洞察。

从严重感染患者的血浆中收集到12种最丰富的蛋白质。将样品装到单个Evotips上进行脱盐，然后用20 μL 0.1% FA洗涤。Evosep One系统(Evosep)与timsTOF Pro耦合。作者优化了短梯度的数据采集，短周期时间为0.5 s，并在数据依赖模式(DDA)中应用并行积累串行碎片(PASEF)，我们以100 Hz的高MS1采样率对多肽进行测序，以实现精确量化，非常适合短梯度测量。在timsTOF Pro仪器上采集的MS和MS/MS数据的m/z范围为100到1700，累积和渐变时间为100毫秒。Bruker otofControl 6.0提供了一个默认的应用程序方法，用于在短梯度上运行PASEF。后期处理由PEAKS工作室完成。

性能色谱柱(EV1137)可用于30 SPD和扩展方法，并装有1.5μm C18磁珠。这将峰宽减少了近50%，同时峰容量增加。因此，蛋白质组的覆盖范围扩大了，利用Evosep One和Bruker tims TOF p

timsTOF Pro提供非常高的测序速度，已经在蛋白质组学稳健性测试中被证明。作者评估了timsTOF Pro与PASEF和Evosep One提供的高通量分离的可行性，以100次/天的速度分析192例严重感染患者的100ng血浆样本。作者首先研究了是否可以在血浆QC样本中稳健地识别出相同数量的蛋白质，并实现了近200个具有量化值的蛋白质的识别。在QC运行中，识别数量的可变性非常低(CV = 3.5%)，这表明MS系统和Evosep One的性能稳定。相比之下，我们发现患者样本数据中量化蛋白组数量的相对变异性要高得多(CV = 20.2%，图2A)。整个研究中QC样品的低可变性证明了LC-MS/MS工作流程的稳定性和可重复性。

由于传统的3D匹配方法没有离子迁移率，因此在匹配过程中存在一定的假阳性识别空间，因此特异性可能较低。timsTOF Pro具有独特的TIMS功能，可以获取离子迁移率信息(1/K0)和计算肽碰撞截面(timsCCS)值。作者利用离子迁移率项(1/K0)在PEAKS studio中采用4D特征匹配方法。4D的应用导致QC样本数据集中每个样本的量化形式从188个显著增加到500个(中值)(图2B)。此外，当应用4D(中位数478)时，样本数据集中的量化蛋白质数量显著更高，相对可变性与未匹配的数据集相似(CV = 16%)(图2B)。

通过观察在整个研究中量化的蛋白质，有和没有4D匹配，很明显，在整个研究中量化的蛋白质没有系统性的变化。在随后的运行中，定量蛋白的较高分散只在样品上可见，而在QC样品上不可见，说明了样品的质量而不是工作流的可变性(图2C)。

图2. 通过MS/MS鉴定和4D特征比对定量蛋白数量

实现更大的蛋白质组学深度的一个常见做法是样品预分馏。这种方法在量化潜在的新生物标志物的蛋白质组学差异方面非常有限，特别是当它们的丰度较低时。无标签方法结合了只有timsTOF Pro上可用的短梯度和4D匹配的高选择性，提供了一个强大的替代方案，可以在适当的采集时间内应用于数千个样本。此外，随着研究规模的增长，这种匹配方法有望在每个样本中产生更多的量化蛋白质。

图3. 血浆样本中蛋白质的定量(QC)

根据以上结果，作者决定进一步评估4D匹配的效用。首先，研究QC样品的定量重现性，作者发现蛋白质定量的相关系数非常高(图3A)。我们在所有样本中定量了同样的364种蛋白质，其中我们发现CV值较低(中值CV = 9.3%，图3B)， 204种蛋白质(56%)的CV < 10%， 320种(88%)的CV < 20%(图3C)。在所有样品的定量结果中，发现样品30-75具有较好的蛋白质定量相关系数，而样品175、180和187相关性较低(图4A)。总共有772种蛋白质被量化，其中66%的识别物只对应血浆蛋白质质量的10%(图4B)，这表明所描述的方法可以达到足够的深度来发现低丰度蛋白质上的生物标志物。最后，作者还量化了一些组织泄漏蛋白，如前列腺特异性抗原(PSA)和细胞因子，如干扰素γ (IFN-γ)，在较低的丰度范围内。加上高通量和灵敏度，已经证明了timsTOF Pro和Evosep One是在大样本队列中发现生物标志物的强大工具。

图4. 血浆样品的蛋白质定量

ro联用，在DDA PASEF模式下30 SPD方法鉴定到5000种蛋白质，扩展方法鉴定到6000种蛋白质。这些鉴定识别依赖于用于分析的软件。研究团队使用MaxQuant进行分析，同时也意识到其他软件工具可以提供不同数量的鉴定。此处描述的性能色谱柱适用于我们的长梯度的方法，有最佳的峰值性能和最大的蛋白质组覆盖率。

1、192例血浆患者的LC-MS/MS检测时间不到2天。

2、timsTOF Pro与Evosep One一起提供仅100 ng胰蛋白酶血浆蛋白消化的强大识别和定量。

3、timsTOF Pro与PASEF的独特特性允许离子迁移信息的常规测量，并在保留时间、m/z和离子迁移率(1/K0)和MS1强度方面实现高质量的4D特征对齐。校准使定量血浆蛋白的数量在一次11.5分钟的LC-MS/MS运行中提高到超过500个蛋白质，如果所有运行合并在一起，共量化772个蛋白质。实现这种深度提供了全新的可能性，分析大样本队列的数百至数千个样本的血浆生物标志物发现。

Keshishian H, Burgess MW, Specht H, Wallace L, Clauser KR, Gillette MA, & Carr SA. (2017) Quantitative, multiplexed workflow for deep analysis of human blood plasma and biomarker discovery by mass spectrometry. Nature protocols, 12(8), 1683-1701