原标题：Pre-analytical stability of serum biomarkers for neurological disease: neurofifilament-light, glial fifibrillary acidic protein and contactin-1

发表期刊：Clin Chem Lab Med

发表时间：2022.03

研究领域：神经系统性疾病生物标志物检测标志物：NF-Light(NFL)、glial fibrillary acidic protein(GFAP)、contactin-1(CNTN-1)检测技术平台：Simoa、Luminex

背景及摘要

由于基于血液样本的生物标志物可以准确地监控、预测神经系统性疾病的病程进展以及治疗预后，因此这些标志物在临床以及科研领域受到越来越多的关注。NFL、GFAP以及CNTN1蛋白在多种神经系统性疾病中均有研究涉及，如多发性硬化(MS)、痴呆、脑肿瘤以及慢性脱髓鞘多发性神经疾病等。上述蛋白在脑脊液和血清样本中的研究表明其与引起神经轴突或轴突胶质功能障碍的不同机制具有相关性。

分析前样本前处理操作的差异可能会影响血液样本中生物标志物的水平，因而需要对相关影响因素进行调查研究并设计一套可应用于神经系统性疾病临床检验以及科学研究的标准操作流程。

现有的研究结果：详见原文参考文献：

1. 血清以及血浆中的NFL水平可在冻融3次内保持稳定;

2. 血清以及血浆分离后在室温或者2-8℃环境下放置7天，其中的NFL水平仍然稳定;2

3. EDTA血浆中的GFAP以及NFL蛋白水平不会受到某些分析前样本处理因素的影响(详见原文参考文献);

4. 血清中的CNTN1蛋白水平可在冻融4次内保持稳定。

其他因素如血液样本延迟离心、血液离心温度以及血清分离后在不同温度保存时间等对血清样本中NFL、GFAP、CNTN1蛋白水平的影响仍不明确。

此外，分析前样本处理因素所造成的影响，在患者与健康人群个体间可能也会有差异;比如，患病个体中的标志物含量若低于正常个体，那么样本间差异变化的检测将更难，所获得的数据可靠性也更低。特别是MS患者中，样本中的蛋白标志物稳定性会由于慢性炎症进程或者使用免疫调节药物治疗等因素而变化;因此，NFL、GFAP以及CNTN1的稳定性需要在对应的疾病群体中进行针对性的确认以实现快速且可靠的临床应用。

本文作者基于MS患者以及对照组，针对一些血清样本前处理中常见的操作差异(采集管类型、全血暂存温度以及时间、离心温度、分离后血清暂存温度以及时间、短期保存、反复冻融次数)对NFL、GFAP以及CNTN1蛋白含量所造成的影响进行了评估，也延续补充了该作者此前发表的针对EDTA血浆样本的前处理操作差异研究。

实验方法及材料

1.受试者：

2.样本处理

与先前EDTA血浆的研究类似，共进行7个不同的样本前处理因素实验，每个实验中均有MS患者以及对照组各5例样本参与，血液样本采集后立即颠倒混匀数次混匀，后续的样本操作根据预先设计的实验条件系统性地进行变化处理;

设置样本处理对照条件：血清促凝管采集血液样本并混匀 → 室温静置30 min → 1800 ×g室温离心10 min分离血清 → 立即按250 ul/管分装在0.5 ml保存管中 → 分装后立即-80℃保存直至进行检测。

3.血清NFL以及GFAP蛋白检测分析

(1)前处理：血清样本室温下短暂解冻混匀并10000 ×g下离心10 min;

(2)使用Simoa单分子免疫分析平台Simoa HD-X以及配套的Neurology 2-Plex B多重检测试剂盒对血清中的NFL以及GFAP蛋白同时进行定量检测;

(3)所有样本中的NFL以及GFAP蛋白均进行2重复检测;

(4)对重复检测数据偏差CV > 25%的样本进行二次重新检测。

4.血清CNTN1检测分析

(1)前处理：血清样本室温下短暂解冻混匀并10000 ×g下离心10 min;

(2)使用Bio-PlexTM 200 system仪器平台以及Human contactin-1 Magnetic Luminex Assay试剂盒进行定量检测;

(3)所有样本均进行2重复检测，且重复间CV需<15%。

5.统计分析

(1)使用Mann-Whitney U检验对比MS患者与正常志愿者样本中的生物标志物水平，p < 0.05视为存在显著差异;

(2)不同前处理测试条件的数据将与对照处理条件数据进行比对，每个测试条件将通过回收率(recovery %)来判断变化程度，回收率偏差>±10%被视为存在显著差异。

主要结果

1.MS疾病组与对照组标志物检测值比对

2.不同前处理差异化操作对血清中NFL/GFAP/CNTN1含量的影响

(1)不同采集管类型的影响：各类采血管检测数据与血清促凝采集管(对照条件)数据进行回收率计算比对

柠檬酸钠采集管中的三类标志物含量均会偏低。

(2)采血后推迟离心分离暂存时间及温度：与对照条件(RT，30 min)数据进行回收率计算比对

NFL采血后2-8℃放置24h后血清中的含量会升高且不稳定，其他测试条件下稳定。

(3)血液离心分离温度：与对照条件(RT离心)数据进行回收率计算比对

测试的血液离心温度条件不影响血清中3类标志物含量。

(4)分离后血清暂存温度计时间：与对照条件(分离后立即-80℃冻存)数据进行回收率计算比对

3类标志物在测试条件内均稳定。

(5)冻融次数：与对照条件(无额外冻融)数据进行回收率计算比对

血清中的CNTN1水平在2次冻融后MS疾病组中的含量会偏高且不稳定。

实验室中操作建议

针对血清中的NFL、GFAP、CNTN1标志物

本文中产生的血清样本前处理操作流程可在多中心临床实验中用于证实MS患者生物标志物结果的可靠性，并且该流程可指导在离患者居住地较近的地方进行血液样本处理。

小结

1.血液样本采集后2-8℃放置6-24小时后MS病人以及正常志愿者血清中的NFL含量会增加，GFAP含量则正常，因而建议全血样本若无法及时分离可在室温下保存;

2.血清中的CNTN1含量对冻融较为敏感，应避免>2次冻融且样本应提前做好分装工作。

参考文献

1.van Lierop ZY, Wieske L, Koel-Simmelink MJ, Chatterjee M, Dekker I, Leurs CE, et al. Serum contactin-1 as a biomarker of long-term disease progression in natalizumab-treated multiple sclerosis. Mult Scler 2021;28:102–10.

2.Hviid CVB, Knudsen CS, Parkner T. Reference interval and preanalytical properties of serum neurofifilament light chain in Scandinavian adults. Scand J Clin Lab Invest 2020;80:291–5.

3. Altmann P, Leutmezer F, Zach H, Wurm R, Stattmann M, Ponleitner M, et al. Serum neurofifilament light chain withstands delayed freezing and repeated thawing. Sci Rep 2020;10: 19982.

4.Verberk IMW, Misdorp EO, Koelewijn J, Ball AJ, Blennow K, Dage JL, et al. Characterization of pre-analytical sample handling effects on a panel of Alzheimer’s disease-related blood-based biomarkers: results from the Standardization of Alzheimer’s Blood Biomarkers (SABB) working group. Alzheimers Dement 2021. https://doi.org/10.1002/alz.12510 [Epub ahead of print]. PMID: 34845818.