肿瘤的发生和发展通常意味着局部组织的一些异常变化，如复杂的基因突变、非自身蛋白质或自身蛋白质的异常表达。

类似于病毒感染后细胞中的外来肽，肿瘤细胞也会通过突变产生的新抗原MHC-I导致它们被呈现CD8 T细胞识别，驱动抗肿瘤免疫反应[1]发生。如果所有原因都是由。MHC-I所呈递的肽放在一起，它们通常被统称为免疫肽组[2]。

目前，肿瘤免疫治疗的关注度很高，如免疫检查点抑制剂、免疫细胞过继治疗、新抗原疫苗等，MHC-I抗原呈现的效率在一定程度上可以解释[3,4];筛选或预测这些新的抗原将有助于肿瘤免疫疗法的发展。

事实上，许多蛋白质组学和免疫实验方法已被用来发现新的抗原，但仅限于体外研究或使用混合肿瘤裂解物，缺乏肿瘤微环境或组织特异性刺激。因此，之前的研究并不能反映肿瘤免疫肽组的全貌。

近日，麻省理工学院Tyler Jacks该团队使用基因工程鼠模型(GEMMs)研究体内肿瘤免疫肽组，试图揭示体内肿瘤抗原呈现的特征。

他们在体内建立了一种纯化细胞特异性pMHC(peptide-MHC)模型小鼠。通过这个工具，他们发现癌症免疫肽组的细胞特征在肿瘤进化过程中丧失，癌症特异性抗原的呈现不是由抗原引起的RNA由丰度或翻译效率驱动。

此外，他们还鉴定了肺腺癌(LUAD)细胞上的免疫原性表面证明，癌症中靶向抗原的范围可能比目前所知道的更广泛。该研究结果发表在《自然》杂志上[5]。

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为构建上述模式小鼠，Jacks团队构建了一个Cre重组酶诱导，编码高度特异性亲和力标签StrepTagII(标签将用于MHC-I位于复合物亲和力纯化的外显子H2-K1号内含子中(KbStrep)。

然后，他们会KbStrep等位基因敲入携带KrasLSL-G12D/ Trp53fl/fl(KP)基因小鼠的胚胎干细胞。这样，在Cre酶腺病毒诱导重组StrepTagII表达后，肿瘤特异性可以从模式小鼠中纯化MHC-I复合物(图2a-b)。

图2 KP/KbStrep小鼠模型的设计

为了检验该模型的有效性，Jacks团队将KP/KbStrep原位应用模型LUAD(图3c)，证明可以分析特异性高、覆盖度深的免疫肽组。

基于抗体免疫沉淀法的分离，他们获得了健康肺或16周荷瘤肺H2-Kb肽;基于肿瘤细胞特异性亲和力的纯化，它们来自16周KP/KbStrep类型(亲和力标签)肿瘤KP/KbWT类型(无亲和力标签)肿瘤肽(图3)d)。

其中，除了KP/KbWT其他样本中获得的肽段具有一定的长度分布、预测亲和力和反映Kb结合氨基酸基序来自KP/KbStrep肽段具有较高的特异性(图3)e-h)。

图3 KP/KbStrep小鼠模型的验证

为了更进一步探索通过亲和纯化分离得到的免疫肽组是否具有较高的细胞特异性，研究者们结合小鼠健康肺的scRNA-seq数据(用于将免疫肽组信息定位至相应细胞表型)，比较了来自健康肺(Normal)、荷瘤肺(Ab)或表达Strep的癌细胞(Strep)中的肽(图4a)。

他们发现，Strep中肺泡2型(AT2)细胞表型显著富集(图4b)，说明肿瘤特异性免疫肽主要来源于AT2细胞，该结果可解释为由AT2细胞特异性SPC启动子表达的Cre重组酶驱动了肿瘤起始(图3d)。

此外，他们还借助杂交手段获得了SftpccreERT2H2-K1Strep/Strep小鼠模型，该模型可通过三苯氧胺诱导StrepTagII特异性掺入健康肺组织中的AT2细胞(图4c)。以此模型作为对照，他们评估了处于8周(早期)、12周(中期)和16周(晚期)肿瘤进展时期的LUAD免疫肽组，发现肿瘤的免疫肽组特征随着肿瘤进展逐渐偏离正常组织，且富集肿瘤免疫肽组的细胞表型，从AT2细胞转向了club/BASC细胞和基底细胞(图4d-f)。

于是，根据免疫肽组的时序变化，Jacks团队进一步分析了肿瘤进展对免疫肽组的影响及其相关的生物学特征。在KP模型中，他们观察到了多肽特征的动态变化，且肿瘤晚期特征与胃上皮模块、高度混合转录基因模块的相关性增加(图4g-h)。

GSEA分析表明，晚期肿瘤多肽特征与炎症细胞因子信号通路正相关，与Myc信号通路、代谢过程和上皮-间充质转化(EMT)负相关(图4i)。此外，他们还关注了KP肿瘤细胞的转移簇特征，说明了MHC-I呈递存在显著的肿瘤内和肿瘤间异质性(图4j-k)。

图4 LUAD免疫肽组在整个肿瘤进化过程中是动态的和异质的

虽然前面的探索澄清了来自KP免疫肽组的广泛特征并不意味着它与健康的肺或正常AT2细胞相比，KP特殊肽在肿瘤中的特征(图5)a)。因此，为了解转录过程和LUAD它们将是特异性肽呈现之间的关系LUAD编码在进度过程中LUAD特异性肽的相对基因mRNA表达水平，正常AT比较2细胞，发现LUAD特异性肽的呈现效率和平均水平mRNA表达水平或预测肽亲和力无关(图5)b)。

这意味着，mRNA单肽的表达变化无法完全解释LUAD特异性呈现效率。Jacks该团队通过识别肿瘤进展的任何阶段的基因，并预测其相应肽的亲和力，最终只有39个LUAD这也证明了以前使用的特异性肽RNA筛选肿瘤特异性抗原肽的局限性(图5)c)。

相应地，Jacks该团队还评估了肿瘤细胞或正常细胞中的蛋白质合成能否更好地预测LUAD特异性肽的呈现。他们得到了正常AT2细胞和KP LUAD细胞器官培养物在体外分析核糖体(Ribo-seq)和转录组测序(RNA-seq)。分析结果表明，与这两种器官各自特征相关的基因翻译率较高(图5)d-e)。

综合分析Ribo-seq、RNA-seq数据后，Jacks团队发现两种器官之间有明显的基因mRNA或RPF(Ribosome Protected Fragment)但是编码LUAD特异性肽的基因通常没有差异，且通过TE(Translation Efficiency)预测获得的肽和LUAD特异性肽的重复率很低(图5)f-g)，也就是说，肿瘤特异性抗原肽不能通过蛋白质合成很好地预测。

图5 LUAD特异性多肽的转录和翻译

最后，Jacks团队在KP/KbStrep在模型中发现了135个非突变肿瘤特异性抗原(TSAs)抗原与147个肿瘤相关(TAAs)(图6a)。

为了验证这两种抗原的免疫原性，这两种抗原的免疫原性(DC)疫苗(3种TSAs，5种TAAs)接种小鼠并使用ELISpot技术检测IFN-γ的分泌(代表着T细胞的应答水平，侧面反映抗原的免疫原性);最终他们发现了三种免疫原性肽，其中两种是无法在体外筛选到的，且难以通过RNA或RPF预测表达(图6b-d)。

他们进一步利用tetramer技术对接种了5周疫苗的KP荷瘤小鼠的CD8 T评估细胞反应性(图6)e-f)，被激活的T细胞确实能识别特定序列的肿瘤抗原肽。他们还分析了其他五种缺乏免疫原性的肽，主要集中在健康小鼠身上AT2细胞在广泛的肺组织中表现不佳，导致错误的猜测(图6g)。

上述分析还表明，与体外或芯片筛选方法相比，细胞特异性免疫肽组学提供了通过经验评估细胞特异性和组织特异性呈现模式的机会，并可以更准确地分类潜在抗原(图6h)。

图6 在LUAD中发现新的肿瘤抗原

总体来说，Jacks该团队的研究不仅揭示了体内肿瘤免疫肽组可以促进对环境特异性抗原的进一步研究，提高我们对肿瘤免疫相互作用的理解的理解;它还提供了一个通用的小鼠模型，帮助研究人员探索健康和疾病中高分辨率的抗原交付机制。期待这项研究能给我们带来更准确的癌症抗原表面和更好的癌症免疫疗法。

参考文献

[1] Ghorani E, Reading JL, Henry JY, et al. The T cell differentiation landscape is shaped by tumour mutations in lung cancer. Nat Cancer. 2020;1(5):546-561. doi:10.1038/s43018-020-0066-y

[2] Dersh D, Hollý J, Yewdell JW. A few good peptides: MHC class I-based cancer immunosurveillance and immunoevasion [published correction appears in Nat Rev Immunol. 2020 Sep 1;:]. Nat Rev Immunol. 2021;21(2):116-128. doi:10.1038/s41577-020-0390-6

[3] Schumacher TN, Schreiber RD. Neoantigens in cancer immunotherapy. Science. 2015;348(6230):69-74. doi:10.1126/science.aaa4971

[4] Miao D, Margolis CA, Vokes NI, et al. Genomic correlates of response to immune checkpoint blockade in microsatellite-stable solid tumors. Nat Genet. 2018;50(9):1271-1281. doi:10.1038/s41588-018-0200-2

[5] Jaeger AM, Stopfer LE, Ahn R, et al. Deciphering the immunopeptidome in vivo reveals new tumour antigens. Nature. 2022;607(7917):149-155. doi:10.1038/s41586-022-04839-2