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简单介绍CAR-T细胞生产过程中的关键环节

发布:大分子生物 阅读量: 药学研究 2022-07-15

嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法作为肿瘤免疫细胞治疗领域的典型例子,已成为肿瘤治疗历史上的里程碑。Coherent Market Insights2018-2028年,全球预测CAR-T细胞治疗市场规模的平均年复合增长将达46.预计到2030年,市场规模将达到218亿美元。

面对如此巨大的市场,制药公司也在加快布局,加快临床进展。数据显示,示clinicaltrials.gov上注册的CAR-T700多个临床项目。纵观中国,共有近40款车型。CAR-T正在开发疗法。随着越来越多CAR-T产品即将进入临床实践,如何快速、大规模地进行相对个性化的生产和制备,确保产品的安全性和质量稳定性,是一个巨大的挑战。

CAR-T细胞生产过程包括T细胞的富集和分离,CAR-T制备细胞和低温储存最终产品。制备过程包括T细胞在体外的激活和扩张CAR基因转导,CAR-T细胞扩张等步骤。本文简要概述CAR基因转导和CAR-T细胞培养这两个关键环节。

简单介绍CAR-T细胞生产过程中的关键环节(图1)

▲ CAR-T细胞产品的制备流程(图源:宜明细胞官网)

关键环节一:CAR基因转导

在基因转导环节,CAR的结构设计、基因转导方式、转导效率等都是关键的影响因素。

自本世纪初,人们一直致力于修饰、改造CAR-T结构的胞内信号转导区,根据“共刺激分子序列”结构的不同,CAR-T 细胞可分以下五代:

第一代CAR-T仅有胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号转导结构域组成,诱导T细胞激活仅通过CD3ζ信号域激活,缺少共刺激信号,细胞活性和效力很弱,需要外源性给予细胞因子;

第二代CAR-T中增加了一个4-1BB、或CD28、或OX40分子共刺激结构域,增强来自TCR-CD3的信号,细胞增殖能力和杀伤毒性都大大的增加,目前大多数产品使用的是二代CAR结构,如:诺华的Kymriah和吉利德的Yescarta;

第三代CAR-T增加了两个或更多共刺激结构域,以提高CAR-T的活性和效力。但是第三代的临床表现并不优于第二代CAR-T;

第四代CAR-T在二代的基础上可表达特定的细胞因子(IL-2、IL-12、IL-15等),克服了肿瘤免疫微环境的抑制,通过修饰肿瘤微环境募集并活化其他免疫细胞进行免疫反应,进一步增强对肿瘤的杀伤作用;

第五代通用型CAR-T敲除异体T细胞上的TCR(T细胞抗原受体)、MHC以及相关信号通路基因,以避免异体型CAR-T细胞的宿主排斥反应。

目前,主要有两种病毒载体用于CAR-T细胞基因转导:γ逆转录病毒载体和慢病毒载体。其中慢病毒载体在科研和临床开发中越来越受到青睐,主要因其具备以下优势:

慢病毒更安全,更低的致癌转化和随机转基因整合风险;

应用范围更广,可转导分裂/非分裂细胞;可以转导多种细胞,包括难以转导的造血前体细胞、神经元细胞、淋巴细胞和巨噬细胞等;

慢病毒转基因负荷量更大,可容纳6.5kb的外源基因且基因毒性更小;

慢病毒介导的基因表达持续且稳定,并随细胞基因组的分裂而分裂;

慢病毒生产成本较低;

慢病毒的转导效率接近100%,高于γ逆转录病毒。‍

高质量的慢性病毒产品作为递送基因的载体工具CAR-T保证细胞药物的有效性和安全性,因此其慢性病毒产品的质量特征是关键。临床试验要求准确调整病毒载体剂量和细胞转导效率,严格控制最终产品质量,确保其安全。

目前,慢性病毒最准确的滴度测量方法是感染细胞后使用qPCR检测靶细胞基因组中的前病毒副本数量。该方法可以区分多个集成事件,减少低估病毒滴度的可能性。该方法的主要缺点是工作量大,需要用病毒制剂的连续稀释剂将靶细胞转化为基因组DNA,并利用病毒成分或转基因本身的引物来量化整合事件的数量。

细胞感染效率的关键参数是感染复数(MOI),也就是说,病毒与细胞数量理论上MOI值越大,感染效率越高,但对细胞的毒性越大,越合适MOI值是高感染效率的关键因素之一。慢病毒的感染能力随细胞类型的不同而不同,因此每种不同的细胞类型需要不同的MOI。理想情况下,MOI线性关系应与感染细胞的数量有关。

但由于病毒结构的复杂性,慢性病毒产品的质量控制也非常重要。慢病毒GMP一些生产的特异性检测包括评估慢性病毒载体的纯度和特性,如蛋白质和DNA污染物;形态和基因组完整性;安全性,如可复制慢性病毒、外源性病原体、支原体、内毒素/热原;病毒效应,如总/活性慢性病毒颗粒;以及最终批次的其他物理和化学性质,如pH、渗透压、电导率。慢性病毒大规模生产的生产能力、成本和质量将直接影响CAR-T产品的最终治疗应用。

宜明细胞作为慢性病毒生产的先驱,建立起来C A洁净级GMP慢性病毒生产车间,自主驯化293TY293TY细胞株可用于贴壁或悬浮培养,细胞培养所需的血清均经病毒因子检测。此外,宜明细胞还独立开发了慢性病毒冷冻液,可以提高病毒的稳定性-80℃保存下在6个月滴度不降低。这一切都可以大CAR-T在提高产品稳定性的同时,制备病毒转导成本。宜明细胞凭借各种灵活的制造技术和丰富的慢性病毒生产经验,可根据具体需要为客户提供定制服务,帮助项目加快商业化进程。

关键环节二:CAR-T细胞扩增培养

在 CAR-T 在治疗过程中,需要进行技术改造 T 体外培养细胞,达到治疗要求的细胞数量者体内靶向杀死癌细胞。CAR-T在生产过程中,补充细胞因子以增强体外CAR-T细胞增殖是一种常见的做法。IL-2可通过调节诱导T细胞扩增IL-早期记忆细胞加早期记忆细胞的数量。

另外,CAR-T细胞扩增还需要重点考虑如何保持CD4 和CD8 T细胞的平衡。此外,当外部刺激因子刺激时,非转导性T细胞也可以扩展。扩展时间仅限于技术和培养系统的选择,通常需要1-2周。目前,T细胞体外的快速扩张仍然是一个挑战,即使有细胞因子,扩张的速度和稳定性仍需要进一步的探索和优化。

目前,绝大多数企业CAR-T细胞制备仍然是纯手动生产,这不仅增加了产品污染的风险,而且容易产生产品批次之间的差异。另外,CAR-TB级条件下的生物安全柜需要保证的无菌性,因此对生产人员的无菌操作提出了很高的要求。CAR-T细胞产品一旦被细菌污染,现有技术就无法消毒。因此,监管部门对细胞治疗产品进行了处理GMP环境清洁度和操作要求特别严格。必须严格验证环境监测,实时监测。而且,CAR-T细胞疗法是一种自体产品,不同患者的细胞应避免交叉污染。

根据中国第一《CAR-T细胞制备质量管理规范,CAR-T细胞产品在生产过程中的各个环节都应严格遵循临床要求。宜明细胞在CAR-T项目经验丰富,细胞治疗领域近100例CAR-T制备经验。其CAR-T细胞制备在绝对A级全封闭隔离器的生产环境中进行。一次性生产过程避免了交叉感染的风险,实现了患者、车间和批次的理想生产模式。在质量管理方面,宜明细胞拥有完善的质量控制体系和专业GMP质量控制团队,能够满足所有GMP项目检测要求。

总之,CAR-T细胞产品作为一种活药物,在生产过程、质量研究、质量控制、放行检测、稳定性研究等方面需要特别考虑,面临更大的挑战,需要更全面、更全面的分析方法来确保CAR-T稳定性和高效性的细胞质量控制方法。

参考资料:

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5.https://xueqiu.com/3483303916/218920271


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