导读：细胞内构象改变的异常蛋白的积累是神经退行性疾病的一个决定性神经病理学特征。患者脑内积聚的致病蛋白采用淀粉样纤维结构，并表现出多种超微结构特征。最近的实验证据表明，这些致病蛋白从宿主细胞向受体细胞的朊病毒样传递是神经退行性疾病发病和进展的基础。为了了解这些异常蛋白质的超微结构和生化分类，东京都医学科学研究所脑与神经科学系的长谷川正人最近在《神经病理学报》上发表了一篇题为“病理性tau的超微结构和生化分类”的论文，α-突触核蛋白和TDP-43“。作者总结了从神经退行性疾病患者大脑中提取的致病蛋白质的超微结构和生化特征。这些蛋白质积累了异常形式的tauα-突触核蛋白和TDP-43，基于最近的实验见解，讨论了这些疾病特异性如何在大脑中保持。

tau、α-synuclein和TDP-43病变

神经退行性疾病的病理标记推理性疾病是错误折叠的蛋白质在神经元和/或神经胶质细胞中的累积。20世纪80年代，有报道称阿尔茨海默病(AD)患者大脑中存在淀粉样蛋白-β(Aβ)和tau累积，一组以异常tau包涵体为特征的疾病被称为tau病变。

此外，有报道称，移植到PD患者体内10-24年后，在移植物中观察到胎儿多巴胺神经元α突触核蛋白病理学。这些报告表明异常α-从宿主细胞释放突触核蛋白并并入移植细胞的可能性。这些报告表明异常α-从宿主细胞释放突触核蛋白并并入移植细胞的可能性。这些病理学发现表明，大脑中积累的异常蛋白质，如朊病毒，通过自身模板自我扩增，并沿着神经回路从一个细胞扩散到另一个细胞。这种假说被称为朊病毒样传播。致病性tau、突触核蛋白和TDP-43的自模板扩增和细胞间传递已在体外和体内实验模型中得到证实。这些实验性传播强烈支持这样观点，即朊病毒样传播与各种神经退行性疾病的发生和进展有关。目前，神经退行性疾病的治疗仅限于对症治疗，但有望开发针对朊病毒样传播的新的疾病缓解疗法和药物。

超微结构和生化特征对朊病毒株多样性的影响

Prusiner 提出了朊病毒假说，它提出了朊病毒样传播的想法，作为解释朊病毒疾病发病机制的一种机制。朊病毒是描述不含核酸的蛋白质感染性颗粒的术语。导致克雅氏病和牛海绵状脑病等朊病毒疾病的朊病毒蛋白 (PrP) 在正常状态 (PrPC) 中富含α-螺旋，而当转化为异常形式 (PrPSc)，它形成富含β-折叠结构的淀粉样蛋白。然后，PrPSc充当模板并自我放大。在从患有朊病毒疾病的患者大脑中提取的不溶于洗涤剂的组分中观察到称为朊病毒棒的淀粉样蛋白结构。这种构象变化使PrPSc能够获得与PrPC不同的各种特性。对感染动物和患者死后组织的生化分析表明，PrPSc具有不同于病毒的独特特征，例如对包括煮沸和紫外线照射在内的常规病毒灭活方法具有抵抗力、不溶于洗涤剂以及对蛋白酶的抵抗力。蛋白酶处理的PrPSc的免疫印迹分析检测到低分子量蛋白酶抗性条带，这些条带模式显示出多样性，具体取决于朊病毒疾病的类型和表达PrPC的宿主物种。对蛋白酶的敏感性差异也被报道。PrPSc生化特性的多样性可能反映了 PrPSc的不同构象。在不同构象的PrP“菌株”中，超微结构和生化特征表现的是菌株的特征，而PrPSc的结构信息对于自我扩增至关重要。因此，PrPSc的结构可能对临床症状和发病机制具有重要意义。在实验动物模型中，菌株已被证明具有不同的感染性和潜伏期。目前尚不清楚哪些因素参与了从同一蛋白质形成不同菌株的过程。然而，可能涉及一些辅因子和PTM。最近，已经证明菌株也存在于淀粉样蛋白中，这些蛋白在患有朊病毒病以外的神经退行性疾病患者的大脑中积累。在与神经退行性疾病相关的致病蛋白中，tau、α-突触核蛋白和TDP-43在细胞内积累并显示常见的PTM。此外，有证据表明它们的积累与神经退行性变之间存在密切联系。因此，我们在这里专注于对这三种蛋白质的神经退行性疾病特异性菌株的超微结构和生化特征进行分类。

源自人tau病变的致病性tau的超微结构和生化分类

Tau是一种微管相关蛋白，主要位于轴突中，是天然未折叠蛋白之一。在成人大脑中，tau以六种亚型存在，由352-441个氨基酸组成，由编码tau的MAPT基因中的外显子2、外显子2和3 或外显子10的可变剪接产生。在由外显子2和3编码的N末端重复结构域中具有0、1 或2个插入片段的同工型分别称为0N、1N和2N。此外，根据微管结合域中的重复次数，这些tau亚型分为三重复tau (3R tau) 和四重复tau (4R tau)。3R tau与4R tau的表达比例约为 1:1。在生理条件下，tau的作用是稳定微管并促进它们的聚合。

Tau病变分为三组：一类是3R tau和 4R tau积累，一类是只有3R tau积累，一类是只有4R tau积累。在AD和慢性创伤性脑病 (CTE) 中，人类tau的所有六种亚型都以神经原纤维缠结 (NFT) 和神经纤维丝的形式积累(图1a)。在AD的早期阶段，用光学显微镜可以看到没有明显纤维结构的tau阳性沉积物，这些被称为前缠结。然而，电子显微镜研究揭示了前缠结中的纤维结构，表明前缠结中的tau纤维并不像NFT那样密集排列和散开。前缠结的出现可能代表了NFT形成的初步阶段。Braak小组用AT8免疫阳性tau评估了缠结前阶段，此外还用Gallyas银染法评估了NFT阶段。星形细胞缠结也是CTE中的一种神经病理学特征。

此外，MAPT基因内含子区域的突变影响可变剪接并改变3R tau和4R tau的表达比率。这些内含子突变导致tau蛋白病的发生，其临床症状和病理学与tau亚型积累的tau蛋白病相似(图 1f)。tau蛋白病患者大脑中积累的异常tau蛋白在多个部位高度磷酸化。这些异常形式的tau缺乏与微管结合的能力并显示出各种PTM，例如泛素化、乙酰化、脱酰胺化和氧化以及磷酸化。已显示在AD案例中，这些PTM的配置文件会根据Braak分期阶段而变化。首先，除了在健康大脑中观察到的磷酸化外，富含脯氨酸和C末端结构域的位点数量和磷酸化频率随着Braak分期阶段的进展而增加。

图1 从人类tau病中提取的致病性tau的超微结构和生化特征

患者来源的tau菌株的实验性朊病毒样扩增和传播

从患者大脑中提取的不溶性tau在体外、培养细胞、原代培养和动物大脑中充当种子，并诱导种子依赖性tau聚集。在蛋白质错误折叠循环扩增 (PMCA) 和实时震颤诱导转化(RT-QuIC)等体外系统中，将从大肠杆菌中纯化的重组tau和来自tau 病患者的样本与配体硫代黄素混合并孵育通过摇动或超声处理，特异性结合β-折叠结构。据硫代黄素荧光强度监测种子依赖性tau聚集。据报道，使用脑匀浆的RT-QuIC可以根据与硫黄素T的反应性将AD和CTE病例与PiD病例区分开来。同样，来自PSP和CBD病例的脑匀浆和脑脊液可以通过RT-QuIC进行诊断。此外，将患者来源的tau种子引入表达tau的培养细胞或原代培养物中会诱导细胞内tau聚集。从AD病例(AD-tau)中提取的不溶性tau会招募3R tau和4R tau进行聚集，而从PiD病例(PiD-tau)或4Rtau病病例中提取的不溶性tau会分别导致仅3R tau或 4R tau的聚集。此外，据报道，将患者来源的tau种子引入荧光共振能量转移生物传感器细胞会诱导形成具有各种形态的tau聚集体,并且这些形态差异在细胞传代过程中遗传。将患者来源的tau种子接种到小鼠大脑中也会导致与接种样品相关的tau病理形成。源自AD、PSP、CBD和AGD病例的脑匀浆在人tau转基因(Tg)小鼠脑中诱导了与接种样品相关的tau病理学，而源自PiD 病例的脑匀浆不会诱导类似皮克体的tau病理学。在用从tau 病变病例中提取的脑匀浆或不溶性部分接种野生型小鼠后，还观察到与接种样品相关的Tau病变，包括细胞类型特异性。此外，据报道，在表达人类tau的所有六种亚型的小鼠中会形成与疾病相关的tau病理。AD-tau诱导的tau病理涉及所有tau异构体，而PiD-tau和从PSP病例(PSP-tau)和 CBD病例(CBD-tau)中提取的不溶性tau分别诱导仅由3R tau或4R tau组成的tau病理。这些结果表明，在tau病变患者的大脑中积累的tau细丝的构象与每种疾病的tau病变的形成有关。

人源突触核蛋白病的致病性α-突触核蛋白的超微结构和生化分类

α-突触核蛋白是一种突触蛋白，在大脑中含量丰富，定位于突触前末端。它由三个结构域中的140个氨基酸组成，N末端结构域、称为NAC(非淀粉样蛋白核心)的疏水区域和C末端富含脯氨酸的疏水区域。在生理条件下，α-突触核蛋白是一种水溶性的、天然未折叠的蛋白质，其功能尚不清楚。然而，α-突触核蛋白基因敲除小鼠的表型表明，α-突触核蛋白可能参与多巴胺的释放。突触核蛋白病分为两大类，路易体病 (LBD)，其特征在于神经元中的α-突触核蛋白包涵体，以及MSA，其特征在于主要在少突胶质细胞中的α-突触核蛋白包涵体。在包括 PD、帕金森病伴痴呆 (PDD) 和 DLB 在内的LBD中，α-syn在神经元细胞体和神经突中以路易体(LB)和路易神经突 (LN) 的形式积聚(图 2a)。在LBD病例的神经元细胞中观察到弥漫性α-突触核蛋白-免疫阳性沉积物和具有纤维结构的苍白小体，表明它们是在LB形成的初步阶段形成的。除了Braak分期，McKeith分期也被广泛用作LBD的神经病理学分期系统。Braak分期评估路易病理学的扩展，而McKeith型根据解剖区域LB病理学的严重程度将LBD分为五种神经病理学亚型。MSA分为以帕金森病为主的MSA (MSA-P) 和以小脑共济失调为主的MSA (MSA-C)，在这两种情况下，α-突触核蛋白作为GCI在少突胶质细胞中积累(图2b)。突触核蛋白病患者大脑中积累的异常α-syn在S129处被磷酸化，并且部分泛素化。过90% 的α-突触核蛋白在DLB患者的大脑中被磷酸化，而在健康大脑中只有4% 被磷酸化。在LBD患者中，不仅在大脑中检测到磷酸化的α-突触核蛋白病理学，而且在食道、心脏、皮肤、肾上腺、肠道和交感神经节等外周组织中也检测到。α-突触核蛋白在各种外周组织中表达，以及α-突触核蛋白病理从外周组织扩散到中枢神经系统也被提出。此外，据报道，突触核蛋白病患者的脑脊液和血液中α-突触核蛋白的浓度增加，这一发现有望为早期诊断提供一种实用的方法。然而，由于α-突触核蛋白大量存在于血小板中，因此诊断需要通过仔细的血液样本检测。据报道，编码 α-突触核蛋白的SNCA基因中的九个错义突变(A30P、A30G、E46K、H50Q、G51D、A53T、A53E、A53V和E83Q)会导致家族性突触核蛋白病。实验发现，与野生型相比，这些突变在细胞毒性、与细胞膜和脂质的关联以及细丝形成方面表现出差异。SNCA基因的复制和三倍复制也会导致早发性LBD。有人提出PrPC和淋巴细胞激活基因3(LAG3)与α-突触核蛋白丝结合并作为受体参与致病性α-突触核蛋白的细胞间传递，但这仍然存在争议，有几份报告表明PrPC与α-突触核蛋白不结合和人类神经元中缺乏LAG3 表达。

图2 从人类突触核蛋白病中提取的致病性α-突触蛋白的超微结构和生化特征

在突触核蛋白病患者的大脑中，异常的 α-突触核蛋白以淀粉样蛋白样纤维结构的形式积聚。LBD大脑中的纤维结构在1960年首次被报道。从突触核蛋白病患者的大脑中提取的肌氨酰不溶性部分的电子显微镜显示直径为5-10nm的α-突触核蛋白细丝，并且来自LBD和MSA病例的α-突触核蛋白细丝之间存在结构差异(图2c)。从LBD案例中提取的α-突触核蛋白细丝是直的，而从 MSA 案例中提取的那些以80-100nm的周期性扭曲(图2c)。已通过低温EM分析确定包括MSA-C和MSA-P的MSA 病例的α-突触核蛋白丝的核心结构。已鉴定出两种类型的α-突触核蛋白细丝，即I型和II型。I 型丝由两条原丝组成，PF-IA由G14-F94组成，PF-IB由K21-Q99组成，而II型丝由两条原丝组成，PF-IIA由G14-F94组成，PF-IIB由G36-Q99组成(表1)。此外，在I型和II型中都可以看到两条原丝之间的额外密度，而不是由于α-突触核蛋白(表1)。尽管这些推定的非蛋白质分子的细节仍不清楚，但表明它们参与了两条原丝的组装。二维分析表明，与从MSA病例中提取的那些不同，从DLB病例中提取的α-突触核蛋白丝没有扭曲。野生型和家族性突触核蛋白病相关突变型合成α-syn丝的核心结构也有报道。与合成tau丝的情况一样，合成α-突触核蛋白丝的结构与MSA病例中鉴定的I型和II型丝的结构都不一致。通过免疫印迹检测到突触核蛋白病患者大脑中积累的异常α-突触核蛋白为17kDa条带(图 2d)。LBD和MSA中α-突触核蛋白抗体检测到的高分子量条带不同：LBD中检测到22、29和37kDa条带，而MSA中检测到22和32kDa条带(图 2d)。据报道，在DLB中观察到的三个高分子量条带中的每一个都是泛素化的α-突触核蛋白，这表明异常α-突触核蛋白的PTM模式在LBD和MSA中是不同的。从LBD和MSA病例中提取的不溶性α-突触核蛋白对蛋白酶的敏感性和蛋白酶抗性条带模式也不同。从 MSA 病例中提取的不溶性α-突触核蛋白(MSA-syn) 比从LBD病例中提取的不溶性α-突触核蛋白(LBD-syn) 对蛋白酶K和链霉蛋白酶的抵抗力更强。此外，MSA-syn具有高SDS溶解度，而LBD-syn显示低SDS溶解度。

患者来源的 α-突触核蛋白菌株的实验性朊病毒样扩增和传播

与tau 一样，从突触核蛋白病患者大脑中提取的不溶性α-突触核蛋白表现出类似朊病毒的特性，并在体外和体内引起种子依赖性α-突触核蛋白聚集。朊病毒样播种活性的异质性也有报道，这取决于α-突触核蛋白菌株。与tau蛋白病的情况类似，来自突触核蛋白病患者的脑、脑脊液和皮肤样本中的异常α-突触核蛋白已被证明可通过PMCA和RT-QuIC方法特异性检测，并且是突触核蛋白病早期阶段有用的生物标志物。使用源自突触核蛋白病病例的脑样本和CSF的PMCA分析揭示了源自PD病例(PD-syn)和MSA-syn的α-突触核蛋白的播种活性存在差异。与PD-syn相比，MSA-syn 诱导硫黄素荧光强度快速增加，而添加PD-syn时的平台期荧光值远高于添加 MSA-syn 时的荧光值。平台期荧光值的变化可能反映了PD-syn 和MSA-syn在α-突触核蛋白丝与硫黄素的结合模式方面的结构差异。通过PMCA方法检测到的PD病例中扩增的α-突触核蛋白聚集体在蛋白酶K处理后显示4个4-10kDa的条带，而在源自MSA病例的α-突触核蛋白聚集体的情况下仅检测到2个 4和6kDa的条带。这两种类型的蛋白酶K抗性条带模式表明根据模板形成不同PMCA产物。在培养细胞和原代培养物中也观察到LBD-syn和MSA-syn之间接种活性的差异(即MSA-syn比LBD-syn诱导更大的细胞内α-突触核蛋白聚集)。此外，在α-突触核蛋白A53T Tg小鼠和野生型小鼠的大脑中表现出MSA-syn的强效朊病毒样特征。然而，在接种MSA-syn的小鼠大脑中，在神经元中观察到α-突触核蛋白病理，但在少突胶质细胞中没有观察到。这可以通过少突胶质细胞中α-突触核蛋白的表达水平来解释。健康大脑和MSA大脑的原位杂交分析表明，α-突触核蛋白在少突胶质细胞中的表达非常低。在形成β-折叠结构之前，正常或寡聚的α-syn可能从神经元分泌并掺入少突胶质细胞中。少突胶质细胞中的α-突触核蛋白病理学已证明在少突胶质细胞中表达α-突触核蛋白的Tg小鼠中形成。需要进一步的研究来阐明神经元衍生的α-突触核蛋白在MSA中GCI形成中的作用。此外，少突胶质细胞与神经元不同的细胞环境可能会影响α-突触核蛋白细丝的形成，从而导致α-突触核蛋白菌株的产生。基于使用重组α-突触核蛋白的研究，已经提出了不同细胞环境可能参与不同α-突触核蛋白菌株形成的可能性。在各种生理条件下形成的合成α-突触核蛋白丝表现出不同的形态和物理特性，并在体外、培养细胞和原代培养物中表现出不同的播种活性、细胞毒性和蛋白酶体活性。在生理盐浓度存在下形成的合成α-突触核蛋白丝表现出显著的细胞毒性，而在没有盐的情况下形成的那些在大鼠脑中表现出高播种活性 这些合成的α-突触核蛋白菌株的脑内接种还会在α-突触核蛋白A53T Tg小鼠和野生型小鼠的大脑中引起各种α-突触核蛋白病理形态和传播模式。

人源TDP-43蛋白病的致病性TDP-43的超微结构和生化分类

TDP-43是一种主要位于细胞核中的RNA结合核蛋白。它由411个具有核转位信号(NLS) 序列的氨基酸组成，由N端结构域、两个RNA识别基序结构域和 C 端富含甘氨酸结构域组成 。TDP-43的生理功能包括调节前体mRNA剪接等加工功能，还参与了mRNA 从细胞核到细胞质的运输。据报道，TDP-43是在FTLD和 ALS患者的大脑中观察到的泛素阳性包涵体的主要成分。异常的TDP-43包涵体大多积聚在细胞质中，TDP-43的核定位及其生理功能均丧失。在FTLD-TDP中，磷酸化和泛素化TDP-43积累，根据病理学和分布的差异分为五种亚型(AE 型)。A型由神经元胞质包涵体 (NCIs) 和短营养不良神经突 (DN)定义(图 3a)。B型，包括伴有运动神经元疾病的ALS和FTLD，主要表现为NCI病理学(图 3b)。C型的特点是长DN(图 3c)。D型主要表现为核内包涵体病理学。E型的特点是粒丝状神经元包涵体和非常细的点状神经纤维包涵体。在FTLD-TDP患者的大脑中观察到TDP-43免疫阳性的弥漫性或颗粒状或短划线样细胞质包涵体，这些前包涵体的形成可能代表TDP-43蛋白病发病机制的早期阶段。边缘优势以及年龄相关性TDP-43脑病(LATE) 的神经病理学特征是磷酸化TDP-43在边缘系统中的积累，并导致老年人出现AD样症状。编码TDP-43的TARDBP基因上的错义突变与 ALS和FTLD-TDP的发病有关。已报道的突变超过30种，其中大部分位于C端低复杂度结构域。其他RNA结合蛋白的突变，包括hnRNPA1、hnPA2B1和 MATR3，以及C9ORF72基因中的六核苷酸重复扩增也会导致TDP-43蛋白病，这表明这些RNA结合蛋白与TDP-43的相互作用和RNA代谢稳态的破坏参与TDP-43的细胞质内积累。最近，已经研究了应激颗粒的形成与TDP-43在细胞质中的积累之间的关联。在各种应激条件下，如氧化应激和热休克，应激颗粒是由RNA和RNA结合蛋白组成的无膜细胞器，通过液-液相分离形成，据报道它们吸收内源TDP-43。然而，尚不清楚应激颗粒的形成是否直接导致TDP-43发病，这需要进一步研究。

图3 从人TDP-43蛋白病中提取的致病性TDP-43的超微结构和生化特征

对具有泛素阳性包涵体的ALS和FTLD病例的脑切片进行免疫电子显微镜研究表明，神经元中存在TDP-43和直径为10-20nm的泛素阳性直丝束。从TDP-43蛋白病患者的大脑中提取的不溶性部分的电子显微镜也观察到直径10-15nm的淀粉样细丝(图3d)。来自AC型的TDP-43细丝的超微结构特征对于每个亚型都是不同的，来自B型的TDP-43细丝比来自其他亚型的细丝更细(图 3d)。据报道，TDP-43的合成肽G274-F313和G314-N353在体外形成细丝，这些细丝具有播种活性，可招募在培养细胞中表达的野生型TDP-43或缺乏NLS的TDP-43用于聚集，这表明残基274–353对于TDP-43细丝的形成很重要。此外，对由SegA(残基311-360)和 SegB(残基286-331，包括ALS遗传突变A315E)肽形成的TDP-43细丝的低温EM分析，揭示了来自SegA细丝的三种不同的匕首形核心结构和一个由SegB细丝的四个R形折叠组成的核心结构。此外，已从TDP-43细丝中鉴定出由F276-M414 组成的纤维核心结构，该细丝由在弱酸性条件(pH4)下形成的低复杂度域 (残基267–414) 组成。对从两个被诊断为患有FTLD的 ALS个体提取的TDP-43细丝进行冷冻电镜分析，发现由G282-Q360组成的双螺旋形折叠，这与上述三种合成TDP-43细丝的纤维核心结构不同(表1)。从具有其他FTLD-TDP亚型的患者的大脑中提取的TDP-43细丝的结构也应该适合低温EM分析。从TDP-43蛋白病患者的大脑中提取的肌氨酰不溶性组分用磷酸化S409/S410抗体进行免疫印迹显示45kDa的磷酸化全长TDP-43条带和亚型特异性CTF条带(图 3e)。在A型中，存在23、24和 26kDa的主要条带和18和19kDa 的次要条带，其中23kDa条带最强(图3e)。类似地，在B型中可以看到18、19、23、24和26kDa的CTF，在24 kDa处具有最强的条带(图3e)。在C型中，可见23和24kDa的主要条带，其中23kDa条带更强烈，可见18和19kDa的次要条带(图 3e)。这些 CTF的条带模式在同一亚型组中很常见，并且可能反映了亚型之间全长TDP-43的N端截断的差异。即使在从一个个体的不同脑区和脊髓提取的不溶性组分中也检测到单一的CTF条带模式。据报道，患者来源的不溶性 TDP-43的蛋白酶抗性条带模式在同种亚型组是相同的，但在不同亚型之间是不同。此外，在从ALS病例中提取的不溶性组分中检测到的主要PTM是磷酸化、氧化和脱酰胺，并且还检测到部分泛素化。这些PTM主要位于C端域。虽然S403/S404和S409/S410的磷酸化是所有亚型的明确病理标志物，但已报道了对S369磷酸化的免疫反应性差异：B型和C型的TDP-43病理学是pS369阳性，而A型是pS369阴性。与tau和α-突触核蛋白一样，这些超微结构和生化变化可能反映了大脑中积累的异常TDP-43构象的差异，这表明在TDP-43蛋白病中形成了TDP-43菌株。在其他亚型和晚期积累的致病性TDP-43 的超微结构和生化特征需要进一步研究。

患者来源的TDP-43菌株的实验性朊病毒样扩增和传播

患者来源的不溶性TDP-43在体外和体内都表现出类似朊病毒的特性。一项 RT-QuIC 研究发现，源自ALS和FTLD病例的脑匀浆和脑脊液中的异常TDP-43使用从大肠杆菌中纯化的全长TDP-43和截短的TDP-43(残基263-414)作为底物进行扩增。TDP-43异常可作为早期诊断的生物标志物。将从 FTLD-TDP AC型患者的大脑中提取的不溶性TDP-43引入表达野生型TDP-43或缺乏NLS的TDP-43 的培养细胞中，导致磷酸化TDP-43的种子依赖性积累。此外，从已引入患者来源的TDP-43种子的细胞中提取的不溶性部分显示出与患者来源的原始种子相似的CTF条带模式。Sarkospin从FTLD-TDP型AC病例中提取的不溶性TDP-43在培养细胞中也显示出不同亚型的细胞毒性和接种活性存在差异。此外，据报道，从 ALS病例中提取的不溶性TDP-43诱导形成具有各种形态的磷酸化TDP-43包涵体，正如在ALS患者的大脑中在表达野生型TDP-43的培养细胞中观察到的那样，并且在培养细胞中积累的不溶性TDP-43的朊病毒样特性在细胞传代后遗传。在体内，将从患有散发性FTLD-TDP和具有GRN或C9ORF72基因突变的家族性FTLD-TDP患者的大脑中提取的不溶性部分脑内接种到在细胞质中表达人源TDP-43的Tg小鼠中，以时间依赖的方式再现了与接种样品相关的TDP-43病理学。将这些源自患者的样本接种到野生型小鼠中也诱导了TDP-43病理学，尽管病理学不如接种到 Tg小鼠中的情况那么丰富。

如何在患者的大脑中维持每种疾病的特征结构和生化特性?

正如我们所描述的，在患者大脑中积累的异常蛋白质表现出每种疾病特有的超微结构和生化特性。值得强调的是，这些特性在同一疾病组中很常见，甚至在一个人的不同大脑区域中也很常见。这些结果表明，致病性tau、α-突触核蛋白和 TDP-43在整个大脑中扩散，保留了它们的疾病特异性结构和生化特性。

为了进一步探索这种可能性，我们检查了疾病特异性tau聚集和细丝形成是否在培养细胞中重现。从tau病变患者的大脑中提取的不溶性tau被引入表达全长3R tau或4R tau的SH-SY5Y细胞中。PiD-tau仅诱导3R tau聚集，而PSP-tau和 CBD-tau仅诱导4R tau聚集。AD-tau招募了3R tau和4R tau进行聚合。在表达3R tau和4R tau的细胞中也观察到这种菌株特异性tau聚集。此外，在SH-SY5Y 细胞中积累的不溶性tau的免疫电镜显示，大量的tau丝被细胞中表达的标签蛋白的抗体标记，其结构类似于来源于患者大脑的细丝。这种在培养细胞中观察到的 tau丝的模板依赖性扩增可以用从大脑中提取的tau丝的核心结构来解释(图 4)。另一方面，PiD折叠、PSP折叠和CBD折叠包含3R tau或4R tau特异性序列，因此，当模板和底物之间存在错配时，不会促进β-折叠结构的聚合(图 4)。换句话说，tau丝的结构决定了哪种tau异构体被招募用于种子依赖性聚集，并且是 tau病理在大脑中形成和传播的决定因素。胰蛋白酶处理的患者来源的tau种子在tau纤维核心区域(绒毛外层)外消化，导致与未处理的tau种子相同的种子依赖性聚集，这支持纤维核心区域在tau细丝扩增中起主要作用的观点。因此，我们的结果表明，大脑中特征性蛋白质的模板依赖性扩增导致同一蛋白质病的病理多样性。

图4 模板和底物之间氨基酸序列的完全匹配对于 tau 火焰的模板依赖性扩增至关重要

通过体外和体内观察由物种障碍引起的低播种和繁殖效率也清楚地证明对模板依赖性扩增的模板和底物之间氨基酸序列同一性的要求。人和小鼠α-突触核蛋白的氨基酸序列有140个氨基酸中的7个残基不同，据报道，当底物和模板来自不同物种时，播种活性显著降低。这可能是由于模板和底物之间的不匹配导致的结构不稳定性。尽管产生不同菌株的机制仍不清楚，但不同的折叠(模板)是由正常蛋白质形成的，这取决于遗传和/或环境因素(图 5a)。

图5 神经退行性疾病中的菌株形成和细胞间传递

总结

患者大脑中积累的异常蛋白质的异质性是神经退行性疾病发病和进展的关键因素。尸检脑的结构和生化分析揭示了致病蛋白的结构多态性(菌株)和朊病毒样特征。值得注意的是，近年来，突触核蛋白丝致病蛋白的tau和α详细结构信息将有助于开发针对蛋白质聚集和细胞间传递的疾病调节剂。疾病特异性纤维核心结构的差异也可能表明每种疾病需要不同的方法。这同样适用于用于早期诊断的pet配体，这可能会导致pet配体的发展，能够区分同一蛋白质疾病中的每种疾病。阐明菌株形成机制及相关因素对于更好地了解神经退行性疾病中的致病蛋白菌株具有重要意义。定义每种疾病的成熟丝在成熟过程中应通过几种不同的形态。阐明疾病特异性折叠是在最初的原纤维形态形成过程中还是在成熟过程中的其他某个点建立的，对于阐明菌株形成的机制和表征从预缠结/预包涵体到纤维包涵体的转变是很重要的。多种致病蛋白之间的相互作用在致病机理中的作用方式以及相互作用的菌株特异性需要进一步研究。由于细胞环境在菌株形成中的重要性已被提出，了解具有聚集的细胞的细胞动力学将有助于阐明聚集、细胞间传递和神经变性的机制，以及菌株形成的机制。

参考文献：

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