原标题：Increasing the reproducibility of fluid biomarker studies in neurodegenerative studies

发表期刊：nature communications

影响因子(IF)：15.805

发表时间：2020.12

研究领域：AD等神经退行性疾病相关生物标志物

前提：本文为Perspective总结性文章，不涉及较多具体的实验设计及数据，相关的实验数据需查阅文中的参考文献。

包括AD在内的神经退行性疾病，其发病率、死亡率以及费用在全球范围均值得引起重视，而且单一使用临床检验手段难以对该类疾病的诊断、预后以及疾病进程监控等方面进行有效评估，这也是该疾病在研究、临床实验以及药物开发等方面推进所面临的主要问题，特别是在该类疾病的早期阶段，临床检验其本身往往无法指导诊断或预测进展，因此，生物标志物因其可以基于脑脊液以及血液样本中的生理病理学相关潜在指标提供客观的度量数据而被作为一种有效的手段用来尝试改善此种情况。

对于AD来说，一些大脑病理变化相关的标志物已经被作为该疾病的研究典范，比如脑脊液中包括Ab42、Ab42/40、total-Tau(T-Tau)以及磷酸化Tau(p-Tau)等在内的一些可再生的生物标志物，在某种程度上已经被用作该类疾病诊断的参考指标;脑脊液中的NFL水平有时也被作为非疾病特异性生物标志物，用于评估神经损伤的程度并佐证神经变性情况。

然而，一些针对非常有前景的标志物研究中发现，其数据及结果无法重现或复制;早在2016年，自然(Nature)杂志发布了一项来自于各个学科共1576名研究者的调查结果显示，有52%研究者认为由于数据选择性报导、文章发表压力、较差的数据统计方式以及分析水平、测试数据重复数不足等因素影响而发表的各类研究结果在数据以及结论重复性上存在“重大危机”，部分小型的研究往往会出现高估或者扩大其片面结果的情况，从而可能使其比一些重要深刻的大型研究结果更容易被引用，这无疑进一步恶化了该问题;结果重复性较差的生物标志物相关发现以及研究，会极大的浪费其他试图重复结果的后续研究者以及实验方法开发人员的时间、精力以及费用。

本文作者为此对神经退行性疾病相关对液体生物标志物重复性问题进行了分析，但并未对已经发表的所有神经退行性疾病相关生物标志物进行系统性定量评价，而是选取了AD研究领域中存在影响重复性问题的不同类型案例进行分析，探究一些针对低重复性的可修正条件，包括队列设计、分析前以及分析因素、数据统计流程等，进而能为其他研究者、药物开发人员以及科学期刊提供一些指导性的建议，实现可重复的结果并进一步提升生物标志物在神经退行性疾病领域的应用。

有许多潜在的因素会导致低重复性情况的出现，诸如队列相关因素、实验前处理因素、实验条件以及试剂相关因素、待测标志物的生物学差异变化、统计方法缺陷、缺乏合适的验证方法以及与提交或接受出版物出版决定有关的因素等，通常会引入随机误差或着系统偏差导致测量结果的不准确。

1.队列设计相关因素：

(1)人群规模大小：

不足的队列设计会增加乐观结果出现的可能性，相比较于大规模人群研究，疾病以及对照人群较少的研究通常会过高估计其原有的表现状况，过高估计一个初期小型实验研究的结果可能会导致发表偏差，通过漏斗图可表明在其他研究中是否存在发表偏倚。

(2)研究对象招募条件/形式：

相较于随机招募形式确定的研究对象，一些有预选或者排除标准应用的研究对象选择形式的重复性可能会低一些，另外，为了减少研究结果的偏差，需要注意避免选择“超级健康”的对照人群，此类人群不仅与患有神经退行性疾病的受试人员有着本质区别，而且与非患病的一般人群也有着较大的差异。

(3)研究对象招募流程：

疾病组与对照组的研究试验过程应当保持一致，如果疾病组与对照组人群是在不同的机构或者不同的时间段进行招募的，会不知不觉的引入一些与生物标志物相关的系统性偏差，从而错误的将这种结果解释为与疾病相关;所有受试组别的成员需要在相同的地点位置、时间段并使用相同标准化流程进行招募操作。

(4)其他多种混杂或额外变化的因素:

主要包括人口统计特征、遗传、药物、肝肾功能或者并发症等因素，比如高学历的病人人群中，“认知储备”可能会减弱生物标志物与临床诊断间的关联性;许多临床诊断为晚发型的AD病例会出现一些诸如a-Synuclein病理、TDP-43沉积、微血管方面的变化，脑白质病变也可能引起脑脊液中多种生物标志物水平的下降等情况;

(5)队列研究预登记：在增加标志物研究透明性的同时，也可在数据收集以及分析前减少对数据的选择性报道。

2.实验相关因素：免疫分析等配体结合型实验

实验分析方法会受到随机以及系统性偏差的影响而干扰数据的可重复性，相关的因素较为复杂，具备一定技术性要求;

(1)检测特异性：检测方法区分预期分析物与其他结构类似物的能力，特异性较差的检测方法会导致标志物水平的系统性偏高，可使用结构相似的材料来验证测试方法的交叉反应程度，例如Ab40与Ab42，NF-light与pNF-heavy等标志物检测彼此间不会发生交叉反应;

(2)检测灵敏度：检测方法在存在多种其他生物组分样本基质中检测预期分析物的能力，可以在样本基质中添加已知量的标志物标准品，通过检测方法的实测值与预期值的比值来评价该方法的检测能力;

(3)标准品类别：参与验证测试用的蛋白标准品通常是重组蛋白的形式，与实际生物体内的内源性标志物可能存在一定的差异，因而相对于实际内源性生物标志物含量，使用重组蛋白的检测结果可能偏高或偏低;

(4)其他因素：

A.样本稀释线性：检测水平应该与样本稀释成比例;

B.平行性：标准品参考水平应与连续稀释样本曲线保持水平;

(5)干扰物质：检测实验方法的灵敏度以及检测结果可能会由于样本中的脂质含量、溶血程度以及异嗜性抗体的存在而出现差异;

(6)稳定性：由于一些已知或未知的因素，检测方法中的试剂可能会由于时间的推移而逐渐发生一些变化，又或者由于不同批号试剂在生产过程中的细微差异而导致最终检测结果的差异，这种差异在同一次研究以及多次研究中均有可能出现，尤其是一些大型的长时间研究项目中，这就需要试剂盒厂家以及供货商尽可能最小化试剂批次间的差异变化;在同个实验室中可通过桥接实验来追踪此类问题，并通过调整标准品浓度来修正检测数据的偏差;

3.实验前处理因素：

即使是已经经过完全验证的实验方法，其检测结果仍然受到前处理阶段各个因素的影响，样本准备时间点、静脉穿刺或者腰椎穿刺过程中操作者的技术水平以及保存管相关的因素;

(1)采样：

正常生理进程中，体内的一些生物标志物在不同时间段会有所差异，或者会由于禁食、压力以及健康状况等条件下产生不同的反应变化，例如，人体血浆中的T-Tau水平可能与睡眠是否充足有关;某些生物标志物的水平可能在24h的生理过程中会出现有规律、循环性的波动变化，因此建议在一天中的相同时间完成样本采集以最小化此类差异。

此外，诸如脑脊液样本中的Ab42、Ab40等蛋白，单一个体内的含量会由于其结构特性以及生理状态的变化而差异较大，因而在临床实际工作中可以使用Ab42/40比值参数替代单一蛋白的数据进行分析，可抵消由于某些原因造成的偏差，此种方法或许也可用于改善脑脊液以及血液样本中其他AD相关生物标志物的准确性;

(2)保存：

血液以及脑脊液样本的采集操作以及保存也会对某些生物标志物含量产生影响，比如脑脊液样本中的Ab42由于其疏水特性，其含量对于前处理操作、保存管类型以及冻融等条件特别敏感。

(3)建议：疾病组以及对照组样本均需完全使用相同的前处理操作流程，可对感兴趣的标志物针对性的进行前处理条件影响的评估，并形成一套可实际应用于临床试验的标准操作流程;

4.实验分析因素：

不同实验室、不同实验以及不同批号间所产生的偏差使得一些关键性阈值结果无法得到复制，同时也阻碍了生物标志物在相关领域的应用;

(1)单次实验内差异：同一次实验中所产生数据的偏差，可在检测时设置所有或者部分样本进行多重复检测来判断;

(2)不同实验间差异：多次不同检测实验间数据的差异，可在每次检测时添加若干个相同的内参质控样本来判断修正;

(3)建议：

A.实验室操作人员需要严格遵循一致的标志物检测流程

B.实验室内具备一套完善的质控体系来判断跟确认偏差的发生以及程度;

C.检测技术人员不知晓所测样本的所有临床数据，疾病组以及对照组样本将被随机的分布在样本板中进行检测;

D.最好的情况是在检测数据确定前，整个检测实验室的所有成员对所检测分析样本的所有信息均不知情。

5.数据统计分析方法因素：

当一项涉及大量生物标志物的实验缺乏扎实基础理论的时候，其研究结果出现假阳性的风险可能会比较高，在蛋白质或者代谢等涉及到几百上千个分子的组学类研究中比较常见，在这些研究中往往需要一些统计判断步骤来进行多方面的数据比对，但是如果存在2个可用的队列，可以允许测试研究队列中出现假阳性结果，并在验证队列进行检测生物标志物时进行严格的调整。

另外一种可能的情况是，从含有一系列大量原始标志物的样本中同时进行多个生物标志物检测时可能会增加低重复性的风险，这类多因子形成的复杂模型，容易导致统计分析时过度拟合，一些噪声数据会被认为是感兴趣的结果;避免假阳性的一个最直接的策略是在测试队列中使用大量的外部验证队列对特定的多个生物标志物进行验证测试。

为了解释检测到的生物标志物变化是否特异性的与某类神经退行性疾病相关或者是否只是出现脑损伤的非特异性应激反应，建议在研究中尽可能的增加不同诊断组别间的比对。

6.验证方法：

所有涉及新型或预期之外标志物的研究结果应当有验证部分的内容，最有说服力的验证方式是在独立的验证队列中体现生物标志物与主要临床终点之间的整体连续相关性，且验证队列必须足够大，才有足够的能力发现测试队列中该生物标志物所产生的效应。如果没有独立的验证队列组别，通常可在原始的组别中进行，将可用的样本按比例分割为训练组以及测试组(比如80%训练组，20%测试组，样本量较小的话训练组比例会更高一些)，前者使对应的生物标志物具备预测结果的能力，后者则用于验证数据结果;为避免测试组的信息渗漏到训练组中，队列应当在分析前完成组别划分，测试队列组别以及验证组别需要单独设立并来源于不同的研究中。

通过二次独立的实验来验证生物标志物，可以增加确定该生物标志物信号真实性的机会，进一步证明该实验方法实际检测的数据与其预期待测目标的一致性。此外，将相同批次分装的样本，同时使用几个不同的实验分析方法进行检测，并对比其中数据的相关性，也可以达到验证评估的目的;

全新发现的生物标志物需要在一个独立且足够大的队列中开展验证工作;研究人员与期刊编辑人员有必要一起合作为生物标志物提供准确的检测制定统一的验证类型标准，尽管经过几十年的研究，并且使用了相对公正的实验方法，包括蛋白质组学和代谢组学在内的多组学研究仍然没有产生足够的生物标志物用于临床实践，因此，需要在数据发表前通过较为公正准确的方法对所检测的生物标志物进行广泛的验证。

通过已发表的一些文章汇总了一些AD、PD等神经退行性疾病相关的液体生物标志物的重复性数据，在不同的研究中有少部分标志物有着几乎一致的结果，表现出极强的可重复性;另外有一大部分标志物的结果存在一定偏差，可能无法明确其重复性，当然也有很多标志物的结果是明确无法进行重复的。

Rank I (高重复性)介绍：少部分的液体标志物与神经退行性疾病有着极强的关联，已在临床试验中普遍应用，其中一些已被用于临床实践中的痴呆诊断检查中

另外也有一些文献报导脑脊液 T-Tau、Ab42以及p-Tau具备AD痴呆预警的能力，表明此类标志物在该疾病的所有临床阶段均会出现强烈的变化，该结论也在其他几个独立的实验中得到重复性验证。

血液样本(血浆、血清)中Ab相关的标志物近些年来有着显著的发展变化，早期针对血浆样本中Ab42以及Ab42/40的研究结果显示AD临床确诊患者与认知未受损伤老年人之间无差异变化，但是一些使用Simoa超灵敏免疫分析等改进型检测方法所进行的研究显示尽管相对于脑脊液所体现的效应要弱，但是血浆血清样本中的Ab42以及Ab42/40指标可以达到AD早期预警的目的，可能该技术相较于早期研究中使用的常规ELISA或者Luminex检测方法有着更强的检测分析能力，造成新老研究结果中这种差异的原因，可能与早期研究中受试者的AD诊断情况偏差有关。

Rank II(重复性不确定组)以及Rank III(无法重复组)相关介绍请参考原文。

随着液体生物标志物研究的深入，更多新的生物标志物会在不同的队列和定量方法进行重复性研究，为了进一步指导临床医生和政策制定者，比较验证这些已经建立了诊断方法的新型生物标志物将变得尤为重要。

无论是在高度专业化的研究场景还是基层操作场景,生物标志物的可重复性都很重要，较差的可重复性在一定程度上会由于前处理操作的差异所产生，并且基层操作场景由于条件较为复杂相对于与高度专业化的场景更难以标准化。就实用性上来说，血液样本中的生物标志物相对于脑脊液样本在基层操作场景上更具优势，因此需要严格控制各类可能影响血液标志物检测的因素，保证结果的可重复性。尽管在基层操作场景中验证生物标志物重复性存在许多障碍和挑战，也正因为如此，那些通过多次重复性试验的生物标志物极有可能被证明在抵抗前处理操作差异方面具有高水平的稳定性，也能够使该类生物标志物被更多的人群接受并应用。

作者以及研究人员应当对于自己所研究的目标尽可能的提供综合全面且细致的数据报告，应当尽可能多的描述一个新的生物标志物具备的潜在用途，最常见的应用是：

(1)诊断中横断面特征的识别;

(2)诊断方法建立后前瞻性的预测特征;

(3)进行疾病随时间变化的生物标志物纵向检测;

一个复杂的生物标志物研究可能包括以上所有这些不同的方面，需要对几个不同的变量进行多次横断面比较和纵向预测，高质量的研究还应尽可能多的阐述关于生物标志物可变性的数据，包括分析变异性以及生物变异性，最后，也应当鼓励编辑人员接受一些整体表现较好但是重复失败的文章数据，以抵消弱化正向的文章发表偏差;此外，为了尽量减少发表偏差，期刊也可以考虑接受论文作为“注册性报告”，用于分析评估，并可以在数据收集开始之前暂时接受发表。

1. Jack, C. R. et al. A/T/N: an unbiased descriptive classifification scheme for Alzheimer disease biomarkers. Neurology 87, 539–547 (2016).

2. Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M. & Zetterberg, H. Cerebrospinal flfluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat. Rev. Neurol. 6, 131–144 (2010).

3. Jack, C. R. et al. NIA-AA research framework: toward a biological defifinition of Alzheimer’s disease. Alzheimers Dement. 14, 535–562 (2018). This is a commonly used framework for Alzheimer’s disease research, which makes biomarker integral to disease defifinitions.