阿尔茨海默症(AD)是一种以认知功能障碍为特征的不可逆神经退行性疾病。AD与年龄有着较大关联，随着全球平均寿命的增加，其症状日益严重。由于药物细化的失败，大量的研究致力于开发治疗AD的策略。中药作为一种潜在的治疗AD方法正受到越来越多的关注。天麻、远志、肉苁蓉、地黄、金钱蒲和姜黄(配比成GPCRAC)都是著名的中草药，具有神经保护作用。

本研究建立东莨菪碱诱导的认知障碍小鼠模型以确定 GPCRAC 提取物在体内的神经保护作用;为了确定GPCRAC提取物改善AD的潜在分子机制，进行了无标签定量蛋白质组学与串联质谱 (LC-MS/MS) 相结合;应用综合生物信息学分析筛选重要经典途径中的核心差异表达蛋白;通过 qPCR 和蛋白质印迹验证了关键改变的蛋白质。结果表明，GPCRAC提取物显著恢复了东莨菪碱诱导的认知障碍，这可以通过改善学习和记忆能力、增加Ach含量和ChAT活性以及降低小鼠海马中的AchE活性来证明。共有390个蛋白质被鉴定为显著差异表达蛋白，其中对照组和模型组之间显著上调110个，显著下调25个。通过映射显著调控的蛋白质，5个关键蛋白，PPP2CA、Gsk3β、PP3CC、PRKACA和BCL-2，被确定，它们分别与多巴胺能突触和细胞凋亡信号通路相关。蛋白质印迹和QPCR表明，这些核心蛋白的表达水平可以通过GPCRAC提取物处理显著提高。GPCRAC提取物可有效缓解东莨菪碱诱导的认知障碍，这可能是通过调节多巴胺能突触和细胞凋亡信号通路。因此，从东莨菪碱处理的模型小鼠获得的定量蛋白质组数据成功地表征了AD相关的生物学改变，并提出了AD的新型蛋白质生物标志物。

论文ID

原名：Chinese HerbalExtracts Exert Neuroprotective Effect in Alzheimer’s Disease Mouse Through theDopaminergic Synapse/Apoptosis Signaling Pathway

译名：中草药提取物通过多巴胺能突触/凋亡信号通路对阿尔茨海默症小鼠发挥神经保护作用

期刊：Frontiers in Pharmacology

IF：5.810

发表时间：2022.02

通讯作者：史渊源 & 赵海滨

通讯作者单位：北京中医药大学

实验设计

实验结果

1. GPCRAC提取物改善东莨菪碱诱导的学习记忆障碍

为了评估GPCRAC提取物在体内的神经保护作用，我们建立了东莨菪碱诱导的认知障碍小鼠模型。采用新型物体识别(NOR)试验、跳台回避(SDA)试验和Morris水迷宫(MWZ)试验评价GPCRAC提取物对东莨菪碱诱导的小鼠学习记忆障碍的神经保护作用(图1)。在NOR试验中，东莨菪碱处理组(模型组)与对照组相比，在识别辨识指标方面表现出低水平的特征，而GPCRAC提取物的中剂量组和高剂量组显著改善了AD小鼠降低的RI(图1A)。通过SDA测试，我们检测到GPCRAC提取物以剂量依赖性方式显著恢复了东莨菪碱诱导的较短跳台潜伏期(图1B)，与模型组相比，高剂量组的GPCRAC提取物显著减少了小鼠的错误次数(图1C)。在Morris水迷宫(MWZ)测试中，AD小鼠比对照组表现出学习和记忆障碍，而高剂量组的GPCRAC提取物改善了认知障碍，这可以通过在移除平台后的最后一天找到平台位点的逃避潜伏期减少和平台区域的更多穿越次数来证明(图1D，E)。在探索期间，东莨菪碱处理的小鼠停留在目标象限的时间减少(图 1F)。此外，定位导航测试中记录的逃避潜伏期显示，AD 小鼠到达平台所需的时间(逃避潜伏期)比对照组和GPCRAC提取物组长，在第4天效果最为显著(图 1G)，表明东莨菪碱暴露后显著的空间学习和记忆障碍。

图1 GPCRAC提取物对东莨菪碱处理小鼠学习和记忆缺陷的改善作用新物体识别能力中新物体的探索时间百分比(辨识指标RI)(A);跳台被动回避测试中的延迟和错误次数(B，C);Morris水迷宫最后一天寻找隐藏平台的逃避潜伏期(D)、穿越次数(E)、目标象限停留时间(F);定位导航测试中的逃避潜伏期(前四天连续训练)(G)。数据表示为平均值 ± SE (n = 17)。与对照组相比，*p < 0.05、**p < 0.01 和 ***p < 0.001;与东莨菪碱处理组相比，#p < 0.05、##p < 0.01和###p < 0.001。

2. GPCRAC提取物改善东莨菪碱诱导的海马神经元损伤

乙酰胆碱(Ach)是第一个被发现的神经递质，在海马记忆功能中起重要作用，并与AD的发病机制密切相关。胆碱乙酰转移酶(ChAT)是一种合成乙酰胆碱(Ach)的酶，被认为存在于脑脊液(CSF)和血浆中，而乙酰胆碱酯酶(AchE)是一种在突触间隙代谢Ach的酶，可导致认知障碍。为了进一步评估GPCRAC提取物对海马神经元损伤的神经保护作用，我们评估了由Ach含量和ChAT活性降低以及AchE活性增加所表明的胆碱能功能障碍。如图2所示，GPCRAC提取物显著逆转东莨菪碱处理小鼠海马组织中Ach含量减少(图2A)、ChAT活性降低(图 2B)以及AchE活性增加(图2C)，尤其是高剂量组，证实了GPCRAC提取物在东莨菪碱暴露后对胆碱能功能的改善作用。结合行为实验，我们的研究结果表明，高剂量GPCRAC提取物有助于缓解东莨菪碱引起的认知障碍，因此，我们选择高剂量GPCRAC提取物进行进一步的机制研究。

图2 GPCRAC提取物对东莨菪碱致认知缺陷小鼠海马胆碱能系统功能障碍的改善作用

根据试剂盒说明书测定海马Ach含量(A)、ChAT活性(B)和AchE活性(C);数据表示为平均值±SE。与对照组相比，*p < 0.05、**p < 0.01和***p <0.001;与东莨菪碱处理组相比，#p < 0.05、##p < 0.01和###p < 0.001 (n=3)。

3. 高效液相色谱分析鉴定了GPCRAC提取物的成分

我们在m/z 120-1800范围内记录质谱。所有数据均使用Xcalibur软件(2.7 版)进行处理。在优化的 UHPLC 和 MS 条件下，主要成分得到了很好的分离和检测(图 3)。通过将UPLC-Q-Orbitrap MS分析与TCMSP数据库(https://old.tcmspe.com/tcmsp.php)和参考文献进行比较，我们鉴定了GPCRAC提取物的化学成分，采用正负离子模式的分子离子峰分析化合物的相对分子质量;然后通过比较色谱保留时间和MS/MS信息对化合物进行定性鉴定。最后，我们从GPCRAC提取物中鉴定出38种化合物，包括天麻素、SibiricoseA5、3,6'-Disinapolysucrose、OnjisaponinB、松果菊苷、毛蕊花糖苷、姜黄素、1',2'-二羟基细辛脑(表1)。

图3 GPCRAC 提取物在正(A)和负(B)离子模式下监测的总离子色谱图

GPCRAC提取物成分分析：GPCRAC提取物有天麻素、3, 6'-Disinapoly sucrose、松果菊苷、毛蕊花糖苷、姜黄素等成分(C)。

表1 UHPLC-Q-Orbitrap正负离子模式分析GPCRAC提取物的化学成分

4. 蛋白质组数据的质量评估

我们使用从东莨菪碱诱导的AD小鼠获得的海马蛋白质组的三个重复样品进行了高通量定量蛋白质组学，基于非标记定量蛋白质组学的流程图如图4A所示。详细地，为了验证AD小鼠模型的海马蛋白质组数据是否可以应用于进一步的AD研究，我们评估了海马蛋白质组的定量重现性(技术和实验条件的差异)。每个样本的标准化蛋白质表达显示出类似的分布(图4B)。

图4 蛋白质组数据的质量评估

基于LC-MS/MS的蛋白质组学分析的工作流程的图解说明(A);在每组三个重复样品中检测到的所有差异表达蛋白的Log2比率分布，由基于FDR <0.05 (B) 的ANOVA确定;从东莨菪碱诱导的AD小鼠(C)中获得的海马蛋白质组的PCA分析。不同组之间的样本相关热图(D)。

5. 差异表达蛋白分析

为了表征蛋白质谱中的差异表达，我们使用偏最小二乘判别分析 (PLS-DA) 模型进一步优化不同组的分离情况 (图5A)。正交偏最小二乘判别分析 (OPLS-DA)是一种监督识别方法，用于加强对照组与模型组(图5B，R2Y = 0.941，Q2 = 0.685)和模型与GPCRAC之间的区分(图5C，R2Y = 0.986，Q2 = 0.79)。随后，我们使用置换检验来评估 OPLS-DA模型可能的过拟合。相应的验证图显示，为不同组的重复样本构建的所有PLS-DA模型都是有效的(图5D，E)。OPLS-DA分类结果显示各组有明显的分离，说明不同组间差异表达蛋白的表达发生显著变化。我们选择MC/NC倍数变化> 1.2或<0.83和p < 0.05的蛋白质进行进一步分析;对4,112种蛋白质的子集进行了定量(独特肽 ≥ 2)，其中390种定量蛋白质被鉴定为差异表达蛋白。蛋白质水平的变化如图5F所示，具体来说，对照组和模型组之间有135个差异表达的蛋白质，其中110个是显著上调的蛋白质，25个是显著下调的蛋白质。并且，我们鉴定了受GPCRAC提取物调节的211种蛋白质(128种上调和83种下调)。模型与对照和GPCRAC提取物与模型之间差异表达蛋白的重叠为9(图5G)。

图5 评估差异表达的蛋白质

不同组样本的PLS-DA得分图(A);OPLS-DA得分图模型显示对照组与模型(B)组和模型与GPCRAC提取物(C)组之间的明显分离;对应的置换检验(D,E);倍数变化截止值设置为 ≥ 1.2 或 ≤0.883，p < 0.05。从每组(F)中鉴定出海马蛋白质组学中上调或下调的蛋白质;差异表达蛋白的维恩图分析(G)。

6. 综合生物信息学分析提示GPCRAC提取物介导的治疗AD的潜在靶点

基于蛋白质组学的综合生物信息学分析，发现GPCRAC提取物在AD治疗中的关键靶点蛋白。首先，通过GO和KEGG分析，我们探究GPCRAC提取物介导的AD治疗中涉及的差异表达蛋白的潜在功能。基因本体(GO)生物学过程分析表明，这些差异表达蛋白主要富集于自噬小体、突触前活性区膜、ATP酶激活物活性、突触后电位、突触后组装的正向调控中，这与AD的病理学与海马神经元的突触功能呈正相关的事实是一致的 (图6A)。KEGG分析显示相关通路，p < 0.05(图6B)。我们在KEGG通路分析中发现了剪接体、RNA转运、核糖体、多巴胺能突触、长期抑制、谷氨酸能突触、GABA能突触、细胞凋亡和其他高度富集项。我们发现大多数通路在调节海马神经功能方面发挥重要作用，其中多巴胺能突触通路是最佳的辨别神经相关通路，表明多巴胺能通路可能是治疗AD靶点富集的必要信号通路。此外，神经元凋亡是AD退行性过程中一个众所周知的通路。

图6 差异表达蛋白的GO富集和KEGG通路分析

GO分析得出的差异表达蛋白的生物学过程(A);差异表达蛋白的KEGG信号通路分析，p值设定为<0.05 (B)。

接下来，为了确定GPCRAC提取物在治疗AD中介导的核心蛋白靶点，我们构建火山图以检测在对照组与模型(图 7A)和模型与GPCRAC提取物(图 7B)组之间显著调节的蛋白质。具体来说，PPP2CA (p63330)、PRKACA (P05132)、PPP3CC (Q80XK0)、GSK3β (E9QAQ5) 和 BCL-2 (P10417) 被证实在模型与对照组中的蛋白质谱明显改变，但在GPCRAC提取物治疗后显著逆转。为了评价这些与AD遗传相关的显著改变的蛋白质的特定变化水平，我们研究了由单个样本与合并样本(称为“标准化蛋白质丰度”)的比率表示的“蛋白质表达水平”。如图7C所示，GSK3β、PPP2CA、PRKACA、PPP3CC 和 BCL-2 的表达水平与火山图一致，在GPCRAC提取物处理后恢复。在这些关键蛋白中，PPP2CA 和 PRKACA在AD组中下调，GSK3β、PPP3CC和BCL-2在AD组中上调。之后，我们利用Pearson的相关热图来解释核心差异蛋白之间相互作用的“迹象”(即激活-抑制关系)。相关矩阵数据(图 7D)显示这些核心调节蛋白之间呈正相关或负相关，PPP3CC和 PRKACA与BCL-2呈正相关，而 PPP2CA和GSK3β 呈负相关。

图7 关键显著调节蛋白质的映射

火山图显示了对照组与模型(A)组和模型与GPCRAC提取物(B)组之间显著改变的蛋白质分布;五种蛋白质(PPP2CA、GSK3β、PPP3CC、PRKACA和BCL-2)被鉴定为AD小鼠海马关键差异表达蛋白。蛋白质的强度作为归一化的蛋白质丰度给出。箱形图 (C) 中显示了五种蛋白质的显著变化水平;关键差异表达蛋白的相关系数热图(D)。

接下来，我们试图进一步证明核心网络中关键蛋白的生物学解释。简而言之，我们使用Cytoscape的Cytohubba插件进行蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI) 网络来表征核心网络内的关键蛋白质变化。前35个节点首先使用最大团中心性(MCC)方法进行排名。关键蛋白及其生物学功能最终被发现。PPI可视化结果表明，几种改变的蛋白质相互之间存在显著联系(富集值p < 0.005)，并且大多数关键差异蛋白主要集中在多巴胺能突触和细胞凋亡信号通路中，此外，这些途径和一些已确定的核心蛋白与AD发病机制有关(图8)。我们最终选择与多巴胺能突触相关的PP2CA、PRKACA、PPP3CC、GSK3β和BCL-2作为进一步的分析目标，因为它们与神经元损伤密切相关。

图8 构建网络模型以阐明核心网络中关键蛋白的生物学解释

构建了对照组和模型组之间 135 种蛋白质的功能性蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI) 网络。MCC排名前 35 的节点。节点填充颜色条表示上调(红色)或下调(绿色)。节点文本颜色条代表 p 值。

7. 蛋白质靶标的验证

我们通过蛋白质印迹和qPCR进一步验证了GPCRAC提取物在介导AD中的关键差异表达蛋白和途径。PPP2CA 编码丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶 2A (PP2A) 催化亚基的α (α)-亚型。PP2A和GSK3β是参与多巴胺能突触通路中突触可塑性调节的必需蛋白，它们与AD中的异常tau磷酸化和神经元死亡有关。此外，PPP3CC和PRKACA也是突触和神经可塑性的重要调节剂，图9说明了这一点。代表性蛋白质印迹图像(图 9A-E)和PPP2CA、P-PKA、PPP3CC、P-GSK3β、BCL-2和Bax的相对光密度值的倍数变化通过蛋白质印迹测定。在暴露于东莨菪碱的小鼠海马中，与对照组相比， PPP2CA、P-PKA、PPP3CC的表达减少(图 9F、G、J)，和P-GSK3β 表达过度激活(图9I)(p = 0.005)。高剂量的GPCRAC提取物导致PPP2CA、PPP3CC、P-PKA和P-GSK3β的表达水平发生相当大的逆转。我们还发现东莨菪碱处理的模型小鼠相对于对照组，其PPP2CA和PPP3CC的mRNA表达水平较低(图 9L，N)，GPCRAC提取物处理后恢复。

图9 RT-qPCR 和WB验证了显著变化的蛋白质

通过蛋白质印迹分别测量小鼠海马组织中 PPP2CA、GSK3β、PRKACA、PPP3CC、BCL-2、Bax 的代表性图像 (A-E) 和蛋白质水平 (n = 3) (F-K);real time-PCR分别检测海马组织中PPP2CA、PPP3CC和Caspase-3的mRNA相对表达量(n=3)(L-N);数据表示为平均值±SE，与对照组相比，*p < 0.05、**p < 0.01和***p < 0.001;与东莨菪碱治疗组相比，#p < 0.05、##p < 0.01和###p < 0.001 (n= 3)。

图10 GPCRAC提取物对AD的多巴胺能突触信号通路的调控

由 GPCRAC 提取物介导的核心差异表达蛋白以红色(上调)和绿色(下调)着色。

讨论

使用中药作为AD的潜在治疗方法是一个不断发展的研究领域。然而，目前中药治疗缺乏有力的实验证据和机制阐述。一些更有效的疗法也正在被开发。在这项工作中，我们首先研究了GPCRAC提取物在减少东莨菪碱诱发的认知障碍方面的神经保护作用。东莨菪碱是一种毒蕈碱胆碱能受体拮抗剂，经常被用作在动物中产生认知障碍的经典药理学模型。

综上所述，上述结果支持GPCRAC提取物对AD的神经保护作用可能是通过生物信息学分析推断出的多巴胺能突触级联和凋亡通路。

结论

总的来说，我们的工作为AD病理过程中突触可塑性改变的分子机制提供了新的见解，并进一步证实了GPCRAC提取物作为一种天然草药方剂改善进行性AD的有效性。然而，由 GPCRAC提取物介导的详细分子机制主要是未知的，值得进一步研究。总之，我们的研究结果表明，GPCRAC提取物治疗可以有效缓解东莨菪碱引起的认知障碍。潜在机制可能与多巴胺能突触/凋亡通路的调节有关。

参考资料：

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35295332/